Бактериофаг - микробиология с техникой микробиологических исследований
Бактериофаги представляют собой вирусы бактерий, которые проходят через мелкопорнстые фильтры и размножаются за счет живых молодых бактерий. Бактериофагия— это процесс взаимодействия бактериофага и бактерий и в точном переводе означает «пожирание бактерий». В последнее время выделены фаги и к лучистым грибам — актиномицетам. Бактериофаги широко распространены в природе. Они встречаются всюду, где есть соответствующие для их существования микробы: воде, почве, молоке, на фруктах и овощах, в организме здоровых людей и животных и т. д. Выделяются они из испражнений при дизентерии, брюшном тифе, холере, из гноя и мокроты при других инфекциях.
Первые наблюдения над явлением бактериофагии принадлежат крупнейшему советскому микробиологу Н. Ф. Гамалее, который еще в 1898 г. показал, что густая взвесь сибиреязвенных палочек в дистиллированной воде может просветляться и приобретать способность растворять бактерии.
Д&rsquo-Эрелль (1917) впервые подверг систематическому изучению явление бактериофагии. Впервые д&rsquo-Эреллем фаг был найден в испражнениях людей, выздоравливающих от дизентерии. Капля фильтрата из испражнений больного человека, внесенная в пробирку с культурой дизентерийных палочек, вызывала постепенное растворение бактерий. При этом д&rsquo-Эрелль установил следующий основной факт: способность вызывать просветление дизентерийных культур, связанная с растворением имеющихся в них бактерий, не только не истощается при этом растворении, а, наоборот, возрастает. Капля просветленной жидкости, перенесенная в свежую взвесь дизентерийных палочек, снова лизирует их. Для наступления феномена д&rsquo-Эрелля два условия являются обязательными: активное начало — бактериофаг и живые размножающиеся бактерии.
Каждый вид фага характеризуется определенной величиной частиц. Размер фагов колеблется в пределах от 20 до 200 ммк, т. е. равен размеру вирусов. Под электронным микроскопом фаг представляется овальным образованием с отростком, напоминая форму сперматозоида (рис. 44). Головка фага состоит из белковой оболочки и наполнена зернистым содержимым (дезоксирибонукленновая кислота). Хвостовая часть представляет собой цилиндрический футляр и сердцевину, напоминая иглу шприца. Отросток фага в 1,5 раза длиннее головки и в 4 раза тоньше (рис. 45). Встречаются круглые и палочковидные фаги. В состав бактериофагов входят: белки, ДНК или РНК, углеводы и липиды.
Рис. 44. Морфология бактериофага.
Видео: Бактериофаги и фаговая терапия
Рис. 45. Схема строения бактериофага.
Поражая микробную клетку, фаг прикрепляется к ее поверхности жгутиками, расположенными па конце отростка. Затем в оболочке бактерий, в участке прикрепления фага, образуется отверстие, через которое внутрь клетки проникает дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) фага. Разрыв бактериальной оболочки обусловлен наличием в фаге литического фермента, располагающегося в хвостовой части оболочки фага. Бактериальная клетка под влиянием внедрившегося фага претерпевает структурные и биохимические изменения. При этом в ней происходит размножение и накопление новых частиц фага. Микробная клетка набухает, увеличивается в размерах, затем оболочка ее разрушается и фаги освобождаются. Освободившиеся фаговые частицы вновь поражают бактериальные клетки. Количество фагов в одной клетке может достигать 200—1000.
По характеру взаимодействия с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги поражают чувствительные к ним микробы, размножаются в них и выделяются в среду при лизисе клетки. Умеренные фаги также инфицируют чувствительные клетки, но вызывают лизис только одной части бактерий с образованием вегетативного фага, большинство клеток приобретает иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению этим фагом. В таких клетках фаги не размножаются, остаются в симбиотическом состоянии и не вызывают лизис бактерий- их называют профагами. Бактерии, несущие такие профаги, называются лизогенными, а симбиоз клетки с профагом — лизогенией. Лизогенные бактерии широко встречаются в природе. Освобождение фага из лизогенной культуры может быть вызвано ионизирующей радиацией, перекисью водорода и другими факторами внешней среды. Тогда лизогенная культура становится нелизогенной и способна продуцировать вирулентные фаги.
Фаги обладают ярко выраженной специфичностью, т. е. они растворяют определенные виды или типы бактерий. Различают монофаги, лизирующие микробов одного вида, полифаги — активные в отношении нескольких родственных видов и типов и фаги, способные лизировать только определенные штаммы одного вида бактерий. В то же время фаги обладают способностью адаптироваться к другим видам бактерий.
По сравнению с большинством одноклеточных организмов фаг устойчив к внешним влияниям. Прямой солнечный и рассеянный свет уничтожает его активность в 2—3 дня- под воздействием ультрафиолетовых лучей фаг гибнет через 10 минут. Большинство фагов выдерживает нагревание до 70°. К химическим и дезинфицирующим веществам бактериофаг более вынослив, чем бактерии. Например, эфир, хлороформ, спирт, толуол тимол, крезол, ацетон, 0,5% раствор сулемы, 1% раствор фенола почти не действуют на фаг. Бактериофаг обладает большой чувствительностью к кислотам и перед его приемом внутрь необходимо выпить слабый раствор соды для нейтрализации кислого содержимого желудка.
Активность фага по отношению к соответствующим микробам может изменяться.
Фаги, как указано было выше, являются вирусами-паразитами бактерий и актиномицетов. О живой природе фага свидетельствуют его структура, механизм действия на бактерии, размножение, способность к адаптации и наследуемая изменчивость.
Для обнаружения фага исследуемый жидкий материал (вода, молоко) центрифугируют. Испражнения и другие материалы полужидкой и плотной консистенции перед центрифугированием разводят физиологическим раствором. Полученную надосадочную жидкость в количестве 1 мл переносят во флакон с 30 мл мясо-пептонного бульона, предварительно засеянного 1 мл молодой (6—18 часовой) культурой микроорганизма, соответствующего искомому фагу. Посев ставят в термостат при 37° на 24 часа. Затем посев фильтруют через фильтр Зейтца, фильтрат разводят стерильным физиологическим раствором 1 : 10, 1 : 100 и 1 : 1000. Из каждого разведения по 1 мл переносят в пробирки и добавляют 0,05 мл соответствующей культуры бактерий. Контролем служит пробирка с 1 мл бульона, содержащего бульонную культуру микроорганизма без фильтрата. Все пробирки ставят в термостат. Через 18—20 часов учитывают результат. Просветление питательной среды свидетельствует о наличии фага, в контрольной пробирке отмечается нормальный рост культуры.
Выявление фага на плотной питательной среде. Чашки Гейденрейха—Петри заливают 1,5% мясо-пептонным агаром, агар остывает, а затем его поверхность засевают по возможности равномерно 16—18 часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Посев должен быть сплошным по всей поверхности агара. Спустя 5—10 минут на подсушенную поверхность питательного агара наносят каплями испытуемые фильтраты в различные секторы чашки. После того как жидкость впитается в среду, чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при 37° на 24 часа. При наличии бактериофага на месте нанесения капли может отсутствовать рост бактерий, или появляются колонии с изъеденными краями или центром, либо множество вполне отграниченных стерильных участков — стерильных пятен (рис. 46).
Рис. 46. Явление бактериофагии.
Количественное содержание фагов выявляется титрованием.
Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Аппельман а. При титровании в 10 пробирок одинакового диаметра наливают по 4,5 мл бульона. В первую пробирку вносят 0,5 мл испытуемого фага. Затем делают последовательные разведения, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл разведенного фага. Из последней 0,5 мл смеси выливают и во все пробирки добавляют по одной капле 18-часовоп бульонной культуры 11-я и 12-я пробирки являются контрольными. В первой из них находится бульон и культура (без фага), во второй— мясо-пептонпый бульон (контроль на стерильность). Все пробирки помещают в термостат при 37° на 18 часов. Последняя пробирка, содержащая прозрачную среду, определяет титр фага. Титр фага — то наибольшее разведение, в котором наблюдается полный лизис, и условно обозначается в виде отрицательной степени разведения. Если последняя пробирка, в которой бульон остается прозрачным, 8-я, то титр данного фага равен 10-8.
Титрование бактериофага и а плотной питательной среде по методу агаровых слоев Грац и а. Этот метод заключается в следующем. Чашки Гейденрейха—Петри заливают 1,5% мясопептонным агаром в количестве 25—30 мл. Для подавления роста воздушной микрофлоры к агару добавляют 0,004% спиртовый раствор генцианвиолета (0,1 мл краски на каждые 100 мл агара). Агар закрывают стерильной фильтровальной бумагой и тщательно его высушивают под бактерицидной лампой в течение нескольких часов или в термостате 30 минут. Чашки закрывают крышкой и оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Затем готовят различные разведения фага, как и при титровании по методу Аппельмана. В пробирки, содержащие по 2,5 мл расплавленного и остуженного до 44—46° 0,7% агара, вносят 1 мл разведений титруемого фага и 0,1 мл известной, чувствительной к этому фагу культуры бактерий. Содержимое пробирок перемешивают, вращая их между ладонями, и выливают вторым слоем в чашки с 1,5% агаром. После равномерного распределения смеси чашки оставляют на 30 минут при комнатной температуре, а затем их помещают в термостат при 37°. После 18 часов пребывания в термостате подсчитывают количество негативных колоний (стерильных пятен) на 2—3 чашках с наиболее высоким разведением фага. Из этих данных выводят среднее арифметическое число колоний и полученную величину умножают на степень максимального разведения. Например:
Разведение фага 10-6 82 колонии,
» » 10-7 51 колония,
» » 10~8 26 колоний.
Среднее число колоний бактериофага 53 (159:3). Титр исследуемого бактериофага равен: 53Х10-8.
Практическое значение фага разнообразно. Его применяют как с терапевтической, так и с профилактической целью (при дизентерии, холере и др.). В хирургической практике применяют стафилококковый, стрептококковый, протейный и синегнойный бактериофаги, а также бактериофаг против возбудителей анаэробной инфекции, который используют местно для орошения ран, влажных повязок, тампонад.
Активнее действуют поливалентные препараты, состоящие из нескольких фагов против различных типов одного вида микробов, а также смесп из различных фагов.
Фаг, как препарат, представляет собой фильтрат бульонной культуры бактерий, подвергшихся фаголизису. Это совершенно прозрачная, свободная от живых микробов жидкость, желтовато-соломенного цвета. Сухой фаг готовят в таблетках с крахмалом или сахаром. Жидкий фаг в прохладном и сухом месте сохраняет свою активность в течение 0,5—2 лет, а сухой уже через 4—6 месяцев хранения значительно теряет свою силу.
В микробиологических лабораториях фаги применяют для целей диагностики, причем феномен лизиса может быть использован в двух направлениях:
а) для определения выделенной культуры при помощи фага, типовая принадлежность которого известна-
б) для определения вида обнаруженного бактериофага при помощи чувствительной к нему культуры бактерий.
Фаготипирование бактериальных культур (брюшнотифозные, дизентерийные) имеет и эпидемиологическое значение, позволяя установить источник и пути распространения инфекции.
Для ускоренной диагностики ряда инфекционных заболеваний (брюшной тиф, дизентерия, чума и др.) в микробиологическую практику В. Д. Тимаковым и Д. М. Гольдфарбом введена реакция нарастания титра фага (РНФ). Сущность этой реакции заключается в том, что к исследуемому материалу добавляют определенное количество индикаторного (специфического) фага и ставят в термостат. Если в исследуемом материале находятся бактерии, соответствующие внесенному фагу, количество корпускул фага увеличится, в противном случае титр бактериофага будет равен исходному (техника постановки РНФ описана в разделе «Микробиологическая диагностика дизентерии» на стр. 261).
Обнаружение бактериофага в воде может служить показателем загрязненности последней соответствующей микрофлорой.
В последние годы фаг широко используется как генетическая модель для изучения многих общебиологических проблем современной генетики.
