Дизентерийные бактерии - микробиология с техникой микробиологических исследований

ДИЗЕНТЕРИЙНЫЕ БАКТЕРИИ (ШИГЕЛЛЫ)
Дизентерия — инфекционное заболевание, характеризующееся поражением толстого кишечника и явлениями общей интоксикации. Возбудителем этого заболевания является группа бактерий, объединенных общим родовым названием — Shigella в честь японского микробиолога Шига, доказавшего роль этих бактерий в этиологии дизентерии.
Различают два вида дизентерийных заболеваний: 1) амебную дизентерию, вызываемую дизентерийной амебой и встречающуюся преимущественно в теплых странах, и 2) бактериальную дизентерию, вызываемую дизентерийными бактериями и распространенную повсеместно.
Палочку дизентерии впервые выделил в чистой культуре А. В. Григорьев в 1891 г. Лишь впоследствии были обособлены виды и типы дизентерийных палочек.
В 1962 г. была утверждена советская классификация бактерий дизентерии (шигелл), в основу которой были положены антигенные и биохимические признаки, присущие основным представителям указанной группы микроорганизмов.
Согласно этой классификации (табл. 16), шигеллы разделяются на две группы:
1) неферментирующие маннит (маннитотрицательные) и 2) ферментирующие маннит (маннитположительные).
К первой группе относятся три вида бактерий: Григорьева—Шига, Штуцер—Шмитца и Лардж—Сакса, которые по антигенной структуре разделяются на 8 типов, ко второй — два вида: бактерии Флекснера и Зонне. Вид Флекснера по своим ферментативным и серологическим свойствам делится на три подвида: собственно Флекснер, Ньюкестл и Бойда.
По антигенной структуре подвид Флекснера делится на 5 серологических вариантов, а подвид Бойда — на 15. Бактерии Ньюкестл, не имея серологических разновидностей, по биохимическим свойствам делятся на три подвида (см. табл. 18). Бактерии Зонне серологических вариантов не имеют, но обладают склонностью к диссоциации на плотных питательных средах. В процессе диссоциации образуются гладкие и шероховатые колонии.

Отечественная классификация дизентерийных бактерий (род шигелл)

1. Не ясно, к какому виду относится,
2. Лишены типовых антигенов.
3. Три ферментативных типа.

Рис. 80.

Гладкие колонии (S-форма) небольшие, прозрачные, бесцветные с ровными краями (рис. 80)- шероховатые колонии (R-форма) — более крупные, плоские, шероховатые, с изрезанными краями, менее прозрачные, чем гладкие колонии.                                                   
Морфология и тинкториальные свойства. Дизентерийные палочки по величине, форме и окрашиванию сходны со всей тифозной группой. В отличие от последних они неподвижны.
Культуральные и биохимические свойства. Растут дизентерийные палочки на обычных питательных средах, подобно тифозным бактериям. На средах с углеводами характеризуются меньшей ферментативной активностью по сравнению с другими представителями кишечно-тифозной группы, при росте на бульоне сероводорода не образуют.
Дизентерийные бактерии лактозу не сбраживают, другие углеводы разлагают только до кислоты. Палочки Зонне вызывают медленное и слабое кислотообразование в среде с лактозой (со вторых суток).
Для отличия дизентерийных палочек от тифо-паратифозных и друг от друга используют: 1) отношение их к углеводам, 2) изучение подвижности, 3) реакции агглютинации. Сходство и отличие признаков дизентерийных бактерий показаны в табл. 17 и 18.
Таблица 17 Биохимические свойства дизентерийных бактерий (шигелл)

Биохимические варианты подвида Ньюкестл1
Обозначения: + ферментирует с образованием кислоты- ± ферментирует не всегда- — не ферментирует.
Таблица 18

Обозначения: К — ферментируют с образованием кислоты, КГ — ферментируют с образованием кислоты и газа- обозначения в скобках означают замедленную реакцию, наблюдение которой ведется в течение 15 суток при 37°.

Резистентность. Резистентность у различных дизентерийных палочек не одинакова. Например, палочки Григорьева— Шига на прямом солнечном свету погибают в течение 30 минут, а бактерии Флекснера и Зонне — за 3 часа. В почве палочки Григорьева—Шига сохраняются в среднем 45 дней, а Флекснера и Зонне — 65 дней. Во льду дизентерийные палочки сохраняются неделями и месяцами. Прогревание при температуре 60° убивает их в течение 10 минут. Фенол и хлорная известь в обычных концентрациях убивают дизентерийных бактерий в течение 30 минут.
Патогенность для животных и токсинообразование. В естественных условиях животные не подвержены заболеваниям бактериальной дизентерией. Искусственное заражение через рот остается безрезультатным. Дизентерийные бактерии Григорьева—Шига вырабатывают экзотоксин. Экзотоксин довольно резистентен по отношению к высокой температуре и выдерживает нагревание до 70°. Остальные виды дизентерийных палочек менее токсичны и выделяют только эндотоксин.
Патогенез и клиника. Источником инфекции при дизентерии является больной человек, реконвалесцент и бактерионоситель. Заражение дизентерией происходит контактно-бытовым путем или через инфицированные продукты и воду. Микробы дизентерии проникают в организм через рот и локализуются в слизистой оболочке толстого кишечника и здесь вызывают сначала острое катаральное, а затем дифтеритическое воспаление. В дальнейшем развивается некротический процесс, в результате чего образуются язвы. Инкубационный период при дизентерии короткий — от 2 до 5 дней. Характерные симптомы заболевания: слабость, рвота, повышение температуры, апатия, жидкие, вначале слизистые, а затем кровянистые испражнения, стул частый, до 40 раз в сутки, сопровождающийся сильными болями. Весьма характерны болезненные тенезмы — безуспешные позывы на дефекацию.
Токсические и тяжелые формы дизентерии вызываются палочками Григорьева—Шига, и некоторыми разновидностями бактерий Штуцер—Шмитца. В настоящее время наиболее распространены формы дизентерии, вызываемые палочками Флекснера и Зонне.
Иммунитет. При дизентерии иммунитет слабо выражен, хотя в крови больных обнаруживают различные антитела (агглютинины, бактериолизины, опсонины, комплементсвязывающие антитела и антитоксины — при дизентерии, вызываемой палочкой                  Григорьева—Шига и токсических формах дизентерии Штуцер — Шмитца).
Этим, по-видимому, и объясняется возможность перехода острой формы дизентерии в хроническую. Отсутствие перекрестного иммунитета (против каждого вида бактерий образуются только специфические антитела) делает возможным повторные заболевания дизентерией, если происходит инфицирование другим видом.
Микробиологическая диагностика. Для исследования на дизентерию необходимо пользоваться свежими испражнениями, по возможности только что полученными от больного, в противном случае процент положительных результатов значительно понижается.
Для собирания кала рекомендуется пользоваться стерильными бумажными тарелками или салфетками, которые вкладываются в судно, промытое горячей водой (обработка судна или горшка дезинфицирующими растворами не допускается, так как небольшие количества последних убивают дизентерийные палочки). При транспортировке кала на большие расстояния собранные фекалии помещают в широкую пробирку с консервирующей жидкостью (30% нейтрального глицерина и 70% физиологического раствора) в количестве 13 фекалий на 23 (5—10 мл) этой смеси. Пробирки должны сохраняться в темном месте при низкой температуре. Посев испражнений должен быть произведен не позднее 12—24 часов с момента взятия.
Консервантом может служить 1,5—3% гипертонический раствор поваренной соли и получившая в последнее время широкое распространение среда накопления Лейфсона. В состав этой среды входит селенистокислый натрий, который стимулирует рост дизентерийных бактерий, одновременно подавляя развитие сопутствующей микрофлоры (кишечной палочки, стафилококков, энтерококков и других микробов).
Приготовление селенитовой среды Лейфсона. В 1 л дистиллированной воды растворяют 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия, 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (NaHP04), 5 г пептона (чехословацкой фирмы «Спофа» или венгерской «Рихтер»), 4 г лактозы, разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром два дня по 30 м при температуре 112° в течение 30 минут.
Отдельно готовят на стерильной воде 10% раствор кислого селенитокислого натрия (NaHSeCb). Перед употреблением на каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора селенистокислого натрия и приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5—7 мл п плотно закрывают пробками,
Прежде чем приготовить среду для употребления, необходимо определить точную пропорцию фосфатов, которая с испытуемым образцом пептона и кислого селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9—7,1, что регулируется изменением количественного соотношения фосфатов.
Такая подтитровка производится всякий раз, когда меняется серия одного из ингредиентов среды (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).
Взятие материала можно проводить при помощи стеклянных трубочек с опаянными концами или с помощью ватного тампона.
Платиновой петлей вылавливают слизистый или слизисто-гнойный комочек, который повторно ополаскивают в стерильном физиологическом растворе и засевают последовательно на три чашки со средой Левина или с бактоагаром Ж.
После 24-часового выращивания посева в термостате исследуют круглые прозрачные нежные бесцветные колонии. Подозрительные колонии отсевают на скошенный агар, на маннит и короткий пестрый ряд с лактозой и глюкозой и через 24 часа учитывают полученные результаты.
Одновременно с материалом из бесцветных колоний ставится ориентировочная реакция агглютинации с видовыми и при необходимости монорецепторными типовыми сыворотками. Положительная реакция с одной из сывороток подтверждает принадлежность микроба к дизентерийной группе. Результат исследования (предварительный) можно выдать через 24 часа.
Вместо короткого пестрого ряда можно использовать среду Ресселя. Эта среда удобна тем, что заменяет три пробирки. Вместо скошенного агара служит скошенная поверхность среды Ресселя (с нее делают препараты, ориентировочную агглютинацию). При сбраживании лактозы и столбик среды и скошенная поверхность окрашиваются соответственно индикатору- при сбраживании глюкозы только столбик среды окрашивается соответственно цвету восстановленного индикатора, а газ скапливается на дне и в виде пузырьков разрывает агар. Глюкоза на среде Ресселя расщепляется только в анаэробных условиях. Культуры, сбраживающие на среде Ресселя лактозу в течение первых суток, считают непатогенными и дают отрицательный анализ. Те же культуры, которые ферментируют только глюкозу до кислоты, подлежат дальнейшему изучению. Готовят препарат для окраски по Граму и определения подвижности и ставят пробную агглютинацию на предметном стекле. Целесообразно применить смесь сывороток против преобладающих в данной местности видов и типов шигелл (например, Флекснера, Зонне, Ньюкестла). При положительном результате культуру испытывают отдельно поливалентной сывороткой Флекснера, сывороткой Зонне и сывороткой Ньюкестла,
Чтобы определить тип и подтип выделенной культуры Флекснера, ее испытывают в реакции агглютинации на стекле сначала с типовыми сыворотками (I, II, III, IV и V), а затем с групповыми (3, 4, 6, 7 и 8). Для окончательной идентификации выделенной культуры ее засевают в среды Гисса с маннитом, мальтозой и сахарозой и в пробирку с бульоном Хоттингера для определения индола и сероводорода.
Основанием для выдачи положительного анализа служат следующие признаки: выделение грамотрицательной, неподвижной палочки с типичными культуральными и антигенными свойствами, характерными для шигелл.
У некоторых больных выделяются атипические палочки, которые не агглютинируются типоспецифической сывороткой. В таких случаях принадлежность микроба к дизентерийной группе устанавливают пробой на фаголизис выделенной культуры поливалентным дезинтерийным бактериофагом.
Обнаружение бактерий дизентерии при помощи увеличения титра фага. Испражнения без консерванта взвешивают и доливают к ним мясо-пептонный бульон (pH 6,8—7,0) из расчета 10 мл на 1 г испражнений, встряхивают с бусами, отстаивают 5—10 минут. Полученную взвесь наливают в 2 широкие пробирки по 9 мл в каждую. В 1-ю добавляют 1 мл индикаторного фага (для выявления бактерий дизентерии) в разведении 1 : 100, во 2-ю — 1 мл бульона. В 3-ю пробирку наливают 9 мл бульона и 1 мл индикаторного фага в рабочем разведении. Из этих трех пробирок 1-я является опытной, 2-я служит контролем на наличие свободного фага, 3-я — контролем титра индикаторного фага. Пробирки ставят в термостат при температуре 37° на 4,5—5 часов для нарастания фага. После этого содержимое каждой пробирки разводят бульоном в 500—1000 раз и больше так, чтобы в 1 мл из 3-й пробирки (контроль фага) получилось такое количество негативных колоний фага, которое можно сосчитать (10—20 корпускул). Содержимое пробирок для инактивации микробов прогревают на водяной бане при 56—58° в течение 30 минут. Затем применяют метод агаровых слоев, который позволяет определить количество корпускул дизентерийного бактериофага. Этот метод заключается в следующем. Три чашки Гейденрейха — Петри заливают 1,5% мясо-пептонным агаром, хорошо подсушивают, а потом наливают второй слой,
который состоит из 2,5 мл расплавленного 0,7% агара, 0,1 мл смыва эталонной культуры дизентерийных бактерий и 1 мл прогретой смеси из пробирок 1, 2, 3-й (в каждую чашку по одной смеси). Через 20—30 минут чашки помещают в термостат на 47г—5 часов, а затем учитывают результаты реакции по стерильным пятнам в чашке с испытуемым материалом (1-я чашка) и в контрольных (2-я и 3-я).
Увеличение титра бактериофага (корпускул фага) более чем в 5 раз в 1-й чашке по сравнению с контролем указывает на присутствие в исследуемом материале дизентерийных палочек.
При хронической дизентерии для диагностики заболевания с сывороткой больного можно поставить: 1) опсоно-фагоцитарную реакцию- 2) реакцию связывания комплемента, 3) реакцию агглютинации.
Методика постановки реакции агглютинации аналогична постановке реакции Видаля с той лишь разницей, что пробирки выдерживают в термостате 18—20 часов.
В настоящее время при диагностике дизентерии широко используется реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами Зонне.
Выделенные культуры дизентерийных бактерий проверяют также на чувствительность к антибиотикам.
Специфическая профилактика и терапия.
В непосредственном окружении предполагаемого дизентерийного носителя или больного хронической дизентерией в качестве профилактического средства применяют. бактериофаг.
Для лечения дизентерии применяют сульфаниламидные препараты (сульгин, фталазол и др.), антибиотики (синтомицин, биомицин, левомицетин, стрептомицин). В случае тяжелой токсической формы заболевания вводят антитоксическую противодизентерийную сыворотку. При лечении хронических форм дизентерии пользуются спиртовой вакциной В. А. Чернохвостова.