Виды микроскопического исследования - микробиология с техникой микробиологических исследований
В микробиологической лаборатории производятся следующие виды исследований:
- Бактериоскопическое — изучение микробов под микроскопом.
- Бактериологическое — изучение микробов методом культивирования (выращивания) на искусственных питательных средах.
- Экспериментальное — определение микробов или их ядов методом заражения животных.
- Серологическое — исследование, при котором, пользуясь определенным антигеном (взвесь микробов, экстракт из органов), можно выявить в сыворотке крови больных специфические антитела или с помощью специфических иммунных сывороток определить вид и тип выделенного из организма микроба.
Методом бактериоскопического исследования определяют морфологические и тинкториальные свойства (способность окрашиваться различными красками) микроорганизмов. При некоторых заболеваниях бывает достаточно одного такого исследования, чтобы определить природу микроба (например, при возвратном тифе, малярии, ангине Венсана, при острой форме гонореи, иногда при дифтерии, часто при туберкулезе и т. д.).
В большинстве же случаев одной бактериоскопии бывает недостаточно и для диагностики приходится переходить к бактериологическому исследованию, т. е. к определению культуральных и биохимических свойств микроорганизмов. Объясняется это тем, что у многих болезнетворных микробов имеются в окружающей нас природе «двойники», морфологически сходные с возбудителями инфекционных заболеваний. Эти микробы — двойники заболеваний — обычно не вызывают и затрудняют микробиологическую диагностику. Метод бактериологического исследования позволяет в таких случаях выяснить истинную природу обнаруженного в исследуемом материале микроорганизма. Бывают и такие случаи, когда лаборанту-микробиологу приходится применить дополнительно еще третий метод исследования (серологический или экспериментальный). Например, при микробиологической диагностике брюшного тифа, дизентерии, холеры для точного определения возбудителя используют заведомо известные иммунные сыворотки, содержащие антитела. При диагностике сибирской язвы, чумы, анаэробных инфекций пользуются заражением животных для определения болезнетворных (патогенных) свойств микроба.
При ряде инфекционных заболеваний (например, при брюшном тифе, бруцеллезе, сыпном тифе, сифилисе) микробиологическая диагностика может быть основана и на обнаружении антител в сыворотке крови больных (серодиагностика).
Микроскоп, его устройство и работа с ним
Микроорганизмы можно увидеть лишь при помощи сложного оптического прибора — микроскопа. Микроскоп (от греческого слова micros —«малый» и scopeo — «смотрю») служит для изучения малых объектов, невидимых простым глазом. В микробиологии микроскопом пользуются для изучения как живых, так и убитых микробов в окрашенном или неокрашенном виде.
В микроскопе различают механическую и оптическую часть (рис. 10).
Механическая часть микроскопа состоит из штатива, в котором различают нижнюю часть, или ножку (7), и верхнюю часть, или колонку (9), соединенную с нижней при помощи шарнира (8). К колонке, которая служит как бы ручкой для переноса микроскопа, прикреплен предметный столик (4), на который помещается исследуемый объект.
Усовершенствованные микроскопы снабжены удобным подвижным предметным столиком, который при помощи винтов передвигается в двух взаимно перпендикулярных направлениях. К верхней части колонки присоединяется трубка микроскопа — тубус (1). Тубус — подвижная трубка, внутри которой находятся линзы, служащие для увеличения исследуемого объекта. Тубус приводится в движение вверх и вниз двумя системами винтов. Для грубой наводки служит зубчатка или кремальера, приводимая в движение макрометрическим винтом (11). Этим винтом пользуются при слабых увеличениях, а также при сильных объективах для первоначальной грубой установки.
Для более точной установки служит микрометрический винт (10), один поворот которого поднимает или опускает тубус иа 0,1 мм. Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа, и обращение с ним требует особой осторожности. Передвигая тубус при помощи этих двух винтов, его устанавливают так, чтобы получить наиболее ясную микроскопическую картину.
Рис. 10. Микроскоп.
1— тубус- 2 — револьвер- 3 — объектив- 4 — предметный столик- 5 — осветительный аппарат (конденсор)- 6 — зеркало- 7 — ножка- 8 — шарнир- 9 — колонка- 10 — микрометрический винт- 11 — макрометрический винт- 12 — окуляр.
Это достигается, когда расстояние от рассматриваемого объекта до объектива равно фокусному расстоянию объектива.
В верхней части тубуса расположен окуляр (12), а к нижней части его прикреплен револьвер (2), в гнезда которого ввинчиваются объективы (3). вращается вокруг оси, что позволяет поставить тот или другой объектив и при желании получить большее или меньшее увеличение.
Оптическая часть — самая важная в микроскопе- состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров.
Осветительный аппарат находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало (6) служит для отражения световых лучей по направлению к объективу и через него внутрь микроскопа. Одна сторона зеркала плоская, другая — вогнутая. Плоским зеркалом пользуются при дневном рассеянном свете, а вогнутым — при искусственном освещении.
Конденсор (5) представляет собой двояковыпуклую линзу, прикрепляемую снизу предметного столика с таким расчетом, чтобы линза конденсора располагалась под отверстием предметного столика. Конденсор служит для собирания (конденсации) пучка световых лучей, что обеспечивает наибольшее освещение исследуемого предмета.
При микроскопировании с дневным светом конденсор необходимо поднять до уровня предметного столика. При искусственном освещении конденсор опускают до тех пор, пока при малом увеличении изображение источника света не появится в плоскости препарата. При микроскопировании неокрашенных препаратов конденсор следует также опустить.
Между зеркалом и конденсором помещается диафрагма, которая регулирует объем лучей, падающих на объектив. Состоит диафрагма из стальных лепестков и при помощи рычага может суживаться или расширяться наподобие зрачка глаза. Окрашенные препараты следует рассматривать при совершенно открытой диафрагме. При рассматривании же неокрашенных препаратов следует сузить отверстие диафрагмы. Объективы составляют наиболее ценную часть микроскопа. Они представляют собой систему двояковыпуклых линз, заключенных в металлическую оправу.
Передняя (фронтальная) самая маленькая линза объектива является главной, производящей увеличение. Лежащие за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения.
Степень увеличения исследуемого объекта зависит от кривизны линзы объектива, которым пользуются. Чем меньше кривизна линзы, тем меньше увеличение и, наоборот, чем больше кривизна линзы, тем больше увеличение.
В микроскопах новейших систем на оправе объективов обозначается даваемое ими увеличение: 8, 10, 20, 40, 60, 90. В микроскопах различают два типа объективов: сухие и иммерсионные, или погружные (от латинского immergo — «погружаю»). При исследовании микробов применяется исключительно иммерсионная, или погружная, система (объектив).
Видео: Исследования спермы
Рис. 11. Ход лучей в иммерсионном и сухом объективе.
Этот объектив дает наибольшее увеличение по сравнению с другими объективами. Погружным он называется потому, что при работе с ним его опускают в каплю жидкости (кедровое масло). Обычно это делается так: каплю кедрового масла наносят на исследуемый объект, а затем при помощи макрометрического винта объектив погружают в эту капельку. Делается это для того, чтобы пространство между исследуемым объектом и объективом было заполнено кедровым маслом, которое конденсирует лучи, поступающие от препарата в объектив. Кедровое масло имеет примерно такой же коэффициент преломления световых лучей, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей.
Если бы между исследуемым препаратом и объективом не было кедрового масла, то пространство между ними было бы заполнено воздухом, который имеет другой коэффициент преломления, нежели стекло. Это привело бы к тому, что световые лучи, проходя через воздух соответственно преломлялись бы и не все попадали в объектив, что значительно снизило бы эффективность наблюдаемой картины (рис. 11).
В отличие от иммерсионного объектива все другие объективы называются сухими, так как при работе они не погружаются в масло.
Окуляры (от латинского слова oculus — «глаз») имеют две линзы: верхняя линза называется глазной, нижняя— собирательной. Расстояние между линзами равно полусумме их фокусных расстояний. Следовательно, по длине окуляра можно приблизительно определить общее фокусное расстояние.
Следует иметь в виду, что увеличивает объект только объектив, окуляр же увеличивает не исследуемый предмет, а только его изображение, получаемое в объективе.
Общее увеличение микроскопа равняется произведению из увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, комбинация иммерсионного объектива Х90 с окуляром Х10 дает увеличение объекта в 900 раз. Микроскопы, которыми обычно пользуются, дают увеличение в 900—1000 раз.
Качество микроскопа зависит не только от степени увеличения исследуемого объекта, но и от его разрешающей силы. Под последней следует понимать то наименьшее расстояние между двумя точками препарата, изображения которых можно отчетливо различать под микроскопом. Чем меньше это расстояние, тем больше разрешающая сила.
Разрешающая сила биологического микроскопа с иммерсионной системой равна 0,2 мк. Следовательно, при пользовании таким микроскопом пределом видимости являются объекты размером не меньше 0,2 мк.
Лаборант в своей практической работе должен помнить, что иммерсионный объектив требует особо бережного обращения с ним. Опускать этот объектив нужно осторожно, чтобы не раздавить стекло препарата, что влечет за собой порчу фронтальной линзы. Погружать иммерсионный объектив в каплю масла на предметном стекле надо под контролем глаза, наблюдая сбоку, причем глаз должен находиться на уровне предметного столика.
По окончании микроскопирования поднимают тубус микроскопа и снимают препарат. Фронтальную линзу осторожно вытирают мягкой тряпочкой, иногда смачивая ее спиртом, разведенным водой 1:1.
В электронном микроскопе имеются электромагнитов линзы: конденсорная, объективная и проекционная, исследуемый объект, помещенный на пути электронов,
отражается на люминесцирующем экране, воспринимающем поток электронов в виде густой тени, соответствующей контурам объекта.
Рис. 12. Советский электронный микроскоп ЭМ-5.
Препараты из исследуемых микробов и их ультратонких срезов готовят на тончайших коллодийных пленках и помещают в приемную камеру микроскопа. Конечную картину наблюдают на люминесцирующем экране. Современные электронные микроскопы дают увеличение в 200 000 раз и более (рис. 12).
