Стрептококки - микробиология с техникой микробиологических исследований
Морфологические и тинкториальные свойства. Стрептококки — Streptococcus (впервые описаны Огстоном в 1881 г.) имеют вид располагающихся цепочками кокков. Длина цепочек весьма разнообразна. В патологическом материале и на плотных питательных средах они короткие из 4—6 отдельных кокков- на жидких питательных средах встречаются необычайно длинные цепочки, в состав которых входит много десятков отдельных кокков (см. рис. 60)- иногда цепочки состоят из парных кокков, имеющих слегка удлиненную форму (диплострептококки). Диаметр отдельных особей варьирует в пределах 0,5—1 мк. Спор и капсул не образуют, жгутиков не имеют. Встречаются такие разновидности стрептококков, которые в патологическом материале имеют капсулу. Стрептококки хорошо окрашиваются анилиновыми красками, грамположительны.
Культуральные и биохимические свойства. Стрептококки представляют собой большую группу бактерий, которая включает много разновидностей, отличающихся друг от друга культуральными, биологическими и патогенными свойствами. Стрептококки растут в условиях аэробиоза или как факультативные анаэробы. На простых питательных средах или совсем не развиваются, или растут крайне скудно, особенно патогенные виды.
Рис. 64. Колонии стрептококка на сахарном агаре.
Для выращивания стрептококков пользуются питательными средами, добавляя к ним 1 % глюкозы, 5— 10% крови, 10—20% сыворотки или асцитической жидкости. Реакция среды слабо щелочная (pH 7,2—7,6). Оптимальная температура 37°.
Через 24 часа роста на агаре развиваются мелкие серовато-белые, слегка мутноватые колонии. Под микроскопом при малом увеличении они имеют зернистый вид. На кровяном агаре колонии крупнее. У одних штаммов они окружены светлой зоной гемолиза (рис. 64). У других вокруг колонии появляется зеленая окраска, наконец, у третьих никаких изменений не наблюдается.
На бульоне стрептококки растут в виде характерного придонного, пристеночного, мелкокрошковатого осадка, оставляя среду прозрачной. Некоторые стрептококки дают диффузный рост.
Стрептококки могут разлагать с образованием кислот (без газа) лактозу, глюкозу, сахарозу и иногда маннит. Некоторые стрептококки обладают редуцирующей способностью.
Резистентность. К физическим и химическим влияниям стрептококки обнаруживают значительную устойчивость. В высушенном состоянии, особенно окруженные белковой оболочкой, сохраняют жизнеспособность при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При нагревании во влажной среде до 70° некоторые разновидности погибают не ранее чем через час. Дезинфицирующие вещества убивают стрептококков в следующие сроки: 1—5% раствор фенола — в течение 15—20 минут в зависимости от концентрации препарата, 0,5% раствор лизола — в течение 15 минут. Под действием риванола в разведении 1 : 100000 и вуцина в разведении 1 : 80 000 стрептококки погибают.
Токсинообразование и патогенность для животных. Картина болезни при стрептококковых инфекциях не оставляет сомнения в том, что стрептококки действуют на организм человека посредством выделяемых ими токсических продуктов. На жидких питательных средах стрептококки выделяют яды типа экзотоксина, обнаруживаемые в фильтратах культур. К экзотоксинам относятся 1) гемотоксин (стрептолизин О и стрептолизин S), растворяющий эритроциты. Этот яд проявляет свое действие как in vivo, так и in vitro- 2) эритрогенный токсин (эритрогенин), который является специфическим скарлатинозным токсином. При введении этого токсина внутрикожно у чувствительных к скарлатине лиц появляется сосудистая реакция в виде покраснения. Этот токсин состоит из двух фракций. Фракция А термолабильна, обладает антигенными свойствами и нейтрализуется антитоксической противоскарлатинозной сывороткой. Фракция В термостабильна и является аллергеном- 3) лейкоцидин, разрушающий лейкоциты и 4) некротоксин, вызывающий некроз ткани. К ферментам относятся фибринолизин (стрептокиназа) и гиалуронидаза.
Наряду с экзотоксинами у стрептококков обнаружены ядовитые вещества типа эндотоксина. Из лабораторных животных к стрептококкам наиболее чувствительны кролики и в меньшей степени морские свинки и белые мыши.
В зависимости от вирулентности культур стрептококки могут вызывать у чувствительного животного местное воспаление или сепсис.
Определение фибринолизина (стрептокиназы). К 10 мл человеческой крови добавляют 1 мл 2% раствора лимоннокислого натрия. После отстаивания отделяют неокрашенную плазму,
Рис. 65. Гемолитический стрептококк. Рост на кровяном агаре.
разводят стерильным физиологическим раствором 1 :3 и добавляют 0,5 мл 18—20-часовой бульонной культуры испытуемого стрептококка. Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню при 42° на 20—30 минут. В это время образуется сгусток фибрина. Пробирки оставляют на 20 минут в водяной бане- при наличии фибринолизина сгусток растворяется в течение 20 минут. Некоторые штаммы стрептококков растворяют фибрин очень медленно, поэтому через 2 часа после стояния в водяной бане пробирки переносят в термостат и результат опыта учитывается на следующий день.
Классификация стрептококков. Первоначально классифицировали стрептококков по длине цепочек (Streptococcus longus, Streptococcus brevis). Такое подразделение оказалось несостоятельным, так как этот признак весьма непостоянен.
Более рациональна классификация Шоттмюллера, в основу которой положено отношение стрептококков к эритроцитам. В зависимости от характера роста на кровяном агаре различают следующие виды стрептококов:
- гемолитический стрептококк — Streptococcus haemolyticus растворяет эритроциты (рис. 65);
- зеленящий стрептококк — Streptococcus viridans образует на кровяном агаре зеленовато-серые колонии, которые окружены непрозрачными зонами оливково-зеленоватого цвета;
- негемолитический стрептококк — Streptococcus anhaemolyticus на кровяном агаре не вызывает никаких изменений.
Патогенными считаются первые два вида. Отношение стрептококков к эритроцитам не является стабильным признаком и варьирует в зависимости от условий их культивирования.
Ленсфильд в основу своей классификации стрептококков положила их антигенную структуру. Реакцией преципитации с бактерийными экстрактами и специфическими иммунными сыворотками было установлено наличие в группе гемолитических стрептококков трех антигенов: нуклеопротеида — Т, протеина — М и полисахарида— С. Наибольшее значение имеет группоспецифический полисахаридный антиген, который дал возможность подразделить гемолитических стрептококков на 17 серологических групп А, В, С, D и т. д. до S, внутри которых различают 53 серологических типа.
В патологии человека в основном играют роль только стрептококки групп А и D. В группу А входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Встречаются они также на слизистой оболочке глотки и носоглотки здоровых людей. Стрептококки этой группы всегда дают гемолиз на чашках с кровяным агаром, не растут на желчно-кровяном агаре, не восстанавливают метиленовую синь в молоке.
Стрептококки группы D (фекальный стрептококк, или энтерококк) являются нормальными обитателями кишечника человека, но при определенных условиях могут вызывать воспалительные процессы (в двенадцатиперстной кишке, желчном пузыре, моче-половой системе). По форме это овальные кокки, располагающиеся парами или короткими цепочками (морфологически сходны с пневмококками). Могут гемолизировать и не гемолизировать эритроциты. Редуцируют метиленовый синий. Энтерококки растут на 40% желчнокровяном агаре и на обычных питательных средах в широких температурных пределах (10—45°). Нагревание выдерживают до 60°. Наличие энтерококков во внешней среде служит показателем свежего фекального загрязнения воды, пищевых продуктов и других объектов.
Анаэробный стрептококк. Грамположительные стрептококки, иногда располагающиеся парами или короткими цепочками. Обычно не гемолитичны. Встречаются на слизистых оболочках, в частности, у женщин в полости влагалища. Были выделены при различных септических процессах.
Патогенез и заболевания у человека. Стрептококки встречаются во внешней среде и в человеческом организме, но значительно реже, чем стафилококки. В организме человека они чаще паразитируют на слизистых оболочках, чем на коже. Стрептококки играют большую роль в развитии многих инфекционных заболеваний. Почти нет такого органа, который гарантирован от поражения стрептококком. Тяжесть заболевания зависит не только от вирулентности стрептококка, но и от резистентности макроорганизма. Этим объясняется то, что стрептококковые инфекции протекают особенно тяжело в тех случаях, когда организм ослаблен, например после ранений, операций, родов. Стрептококки вызывают рожу (воспаление кожных лимфатических путей), абсцессы, флегмоны (воспаление подкожной клетчатки). Стрептококки обнаруживаются при острых катаральных воспалениях слизистых оболочек (например, при ангине). При ангине стрептококк может из пораженных миндалин поступать в кровь и с током крови заноситься во внутренние органы, вызывая нефрит (воспаление почек), эндокардиты (воспаление внутренней оболочки сердца), поражения суставов и т. д. Стрептококк — самый частый возбудитель сепсиса.
Исключительно велика роль гемолитического стрептококка при скарлатине. Г. Н. Габричевский в 90-х годах прошлого столетия впервые высказал предположение о стрептококковой природе скарлатины и с успехом проводил вакцинацию убитыми культурами скарлатинозного стрептококка.
В последние годы стрептококковая теория скарлатины нашла подтверждение в работах многих исследователей. Они получили при помощи скарлатинозного стрептококкового токсина экспериментальную скарлатину, а иммунизацией малыми дозами токсина прочный иммунитет. Зеленящий стрептококк вызывает хронический сепсис, осложняющийся эндокардитом, который характеризуется длительным течением и субфебрильной температурой.
Иммунитет. Врожденная резистентность к стрептококкам у людей неодинакова. Некоторые люди мало подвержены стрептококковым поражениям, другие же, наоборот, обладают повышенной чувствительностью к ним.
После перенесенных стрептококковых заболеваний получается нестойкий иммунитет. Нередко возникает сенсибилизация (аллергизация) организма к стрептококку (рецидивирующая рожа, привычные ангины и т. д.).
Иммунитет к стрептококкам имеет двоякий характер: антимикробный и антитоксический. В крови иммунных животных и людей, перенесших стрептококковые инфекции, обнаруживают агглютинины, преципитины, бактериотропины и антитоксины.
Микробиологическая диагностика. Материалом для лабораторного исследования служат гной, воспалительные экссудаты, налет с миндалин, кровь, моча. Методика микробиологического исследования примерно такая же, как и при стафилококковых заболеваниях. При наличии открытых гнойных процессов гной берут стерильным ватным тампоном или пастеровской пипеткой, капиллярный конец которой затем запаивают. Слизь или налеты из зева берут стерильным тампоном, мокроту собирают в стерильную посуду. При подозрении на стрептококковый сепсис из локтевой вены берут 10 мл крови (предварительно следует тщательно простерилизовать кожу в локтевом сгибе) и у постели больного засевают на сахарный (с 1% глюкозы) или сывороточный бульон. Исходный материал, кроме крови, подвергают бактериоскопическому исследованию: готовят мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом (рис. 66 на вклейке).
Рис. 63. Стафилококк в гною. Окраска по Граму.
Рис. 66. Стрептококк в гною. Окраска по Граму.
При обнаружении под микроскопом расположенных цепочками грамположительных кокков ориентировочно устанавливают стрептококковую этиологию заболевания.
Далее следует высеять материал на чашки с сахарным и кровяным агаром для получения изолированных колоний и выделения чистой культуры. Мелкие (0,5 мм), плоские, суховатые, сероватые, прозрачные колонии стрептококка позволяют дифференцировать вид стрептококка (гемолитический, зеленящий, негемолитический).
Для определения редуцирующей способности стрептококков 0,1 мл 18-часовой испытуемой бульонной культуры засевают в 5 мл молока с метиленовой синью (среда состоит из стерильного снятого молока, к которому добавлен 1% водный раствор метиленовой сини в количестве 2 мл на 100 мл молока) и ставят в термостат при 37° на 24 часа. При положительной реакции молоко обесцвечивается, при отрицательной — цвет среды не изменяется.
Для определения вирулентности и токсигенности стрептококков кролику вводят путем внутрикожной инъекции 200—400 млн. микробных тел. Через 24—48 часов на месте введения культуры появляется воспалительная реакция различной степени, с некрозом или без него.
Идентификация гемолитических стрептококков осуществляется также с помощью реакции агглютинации и преципитации.
Реакция агглютинации. На предметное стекло наносят отдельными пастеровскими пипетками одну каплю физиологического раствора и по капле агглютинирующих групповых сывороток А, В, С, D (цельные или разведенные физиологическим раствором 1 :2 или 1 : 10), в которые вносят по капле исследуемой бульонной культуры. Если культура не очень зерниста и не дает самопроизвольной агглютинации, то в течение получаса можно определить группу стрептококка. Кроме группы, можно определить тип стрептококка внутри группы А. Типирование проводится также при помощи реакции агглютинации на стекле с типоспецифическими сыворотками и по той же методике, что и определение группы.
Специфическая профилактика и терапия. Вакцинация и вакцинотерапия не нашли широкого применения при стрептококковых заболеваниях. Чаще используют поливалентную противострептококковую сыворотку. Высокой активностью при лечении стрептококковых заболеваний отличаются препараты сульфаниламидного ряда. Эти препараты как при приеме внутрь, так и при местном применении или парентеральном введении оказывают резко угнетающее действие на стрептококков. Для лечения стрептококковых инфекций с большим успехом применяют антибиотики — пенициллин, тетрациклин и др.
