Лептоспиры - микробиология с техникой микробиологических исследований
Лептоспиры являются возбудителями острых инфекционных заболеваний — лептоспирозов, которые поражают человека, грызунов, крупный рогатый скот, овец, свиней, собак и других животных.
Впервые патогенные лептоспиры были обнаружены в 1914 г. японскими исследователями Инадо и Идо, которые выделили их из органов морской свинки, зараженной кровью больного инфекционной желтухой. Эти спирохеты были названы ими Spirochaeta icterohaemorrhagiae.
В 1928 г. С. А. Тарасовым выделен возбудитель водной лихорадки Leptospira grippotyphosa. Такое название лептоспире было дано ввиду некоторого сходства клинической картины водной лихорадки с гриппом, а отчасти с тифозным заболеванием.
Различают две формы лептоспироза: инфекционную желтуху, или болезнь Васильева—Вейля (желтушный лептоспироз — возбудитель L. icterohaemorrhagiae), и безжелтушные лептоспирозы (водная лихорадка, покосная, дальневосточная лихорадка и др.), которые вызываются различными лептоспирами L. grippotyphosa, L. batavia, L. canicola, L. DBA и др.
Морфология и тинкториальные свойства. По морфологическим и культуральным свойствам все лептоспиры сходны между собой. Лептоспиры характеризуются чрезвычайно мелкими многочисленными завитками. В длину лептоспиры имеют 6—9 мк, а в толщину 0,25 мк. В центре они несколько толще и вытягиваются по направлению к концам. Последние заканчиваются пуговчатыми утолщениями (рис. 108). Лептоспиры обладают активной подвижностью. Они содержат в своем теле очень мало нуклеопротеидов и потому трудно окрашиваются (по Романовскому в розовый цвет, при серебрении— в коричневый или черный). К тому же эти методы окраски настолько изменяют структуру лептоспир, что распознавание их становится крайне затруднительным. Поэтому для их обнаружения применяют метод исследования в темпом поле зрения (в живом состоянии).
Культивирование. Культуру лептоспир легко получить на средах, содержащих минимальное количество белка.
рис. 108. Лептоспиры инфекционной желтухи (чистая культура).
Для культивирования лептоспир применяют следующие питательные среды:
- Раствор пептона в водопроводной воде (1:1000) с добавлением нескольких капель метафосфорной кислоты.
- Среда Уленгута, состоящая из стерильной водопроводной воды с 10% сыворотки кролика, прогретой при температуре 56—58° в течение 30 минут.
- Фосфатно-сывороточная среда Терских — смесь 10 мл Vi5 М раствора Na2HP04 и Vis М раствора КН2Р04 с 90 мл дистиллированной воды: смесь стерилизуют и добавляют 10% прогретой сыворотки кролика.
После посева среда покрывается слоем жидкого парафина или вазелинового масла. Первые дни посев рекомендуется выдерживать при температуре 32°, последующие дни — при 25—28°. Рост лептоспир начинается на 5-й день или позднее. Лептоспиры не вызывают помутнения бульона. Наличие лептоспир определяется микроскопическим исследованием в темном поле зрения.
Резистентность. Нагревание в воде убивает спирохет в течение 30 минут при 50—55°.
Безжелтушные лептоспирозы — водная лихорадка протекает более доброкачественно, без явлений желтухи и кровоизлияний. На 4—7-й день болезни в области ключиц иногда появляется полиморфная сыпь, которая постепенно распространяется на туловище и конечности. Через 2—3 дня сыпь бесследно исчезает. Температура держится около недели. Обычный исход болезни — выздоровление.
Иммунитет. Повторные заболевания наблюдаются редко. В крови больных обнаруживают лептоспиролизины и агглютинины.
Микробиологическая диагностика. Материалом для лабораторного исследования служит кровь больного в первые дни болезни при наличии повышенной температуры, моча с 10—12-го дня, при менингеальных явлениях спинномозговая жидкость, по эпидемиологическим показаниям вода, пищевые продукты, трупный материал (органы погибших от лептоспироза людей и животных).
Применяют: 1) микроскопический метод исследования, 2) посев материала на питательную среду, 3) серологические методы исследования и 4) биологическую пробу.
Для микроскопического исследования крови ее набирают (2—3 мл) из вены в шприц с 4 мл 1,5% раствора лимоннокислого натрия. Смесь выливают в пробирку,центрифугируют, отделяют осадок. Мочу и спинномозговую жидкость можно исследовать без всякой обработки или после центрифугирования в течение нескольких часов при 4000 об/мин. После центрифугирования жидкость выливают, а осадок исследуют. Каплю исследуемого материала наносят на тонкие предметные стекла (не толще 1 мм) и накрывают покровным стеклом (не толще 0,2 мм). Полученный препарат «раздавленной» капли рассматривают в темном поле. В препарате будут видны тонкие серебристо-белые подвижные лептоспиры.
Так как микроскопическое исследование дает небольшой процент положительных результатов, необходимо выделить чистую культуру лептоспир. Кровь больного, взятую из вены (5 мл), засевают в 3 пробирки (2 мл, 1 и 0,2 мл) с бессывороточной средой. В самой крови содержится достаточное количество питательных веществ для роста лептоспир. Мочу и спинномозговую жидкость засевают по 0,5—1 мл в 3—4 пробирки среды, содержащей сыворотку кролика. От трупа человека или животного берут небольшие кусочки почек, селезенки, печени, мозга, растирают в фарфоровой ступке с 2—3 мл физиологического раствора. Все это проделывают стерильно. Полученную взвесь сливают в пробирки, отстаивают 1 час. Верхний слой отстоявшейся жидкости микроскопируют, а затем засевают по 1 мл на 3—4 пробирки питательной среды. Посевы ставят в термостат и каждые 5 дней (на протяжении 3 месяцев) из них готовят препараты для микроскопии в темном поле.
При посеве загрязненного материала (осадка мочи, воды и т. д.) наряду с размножением лептоспир наблюдается рост посторонней микрофлоры. В этих случаях для получения чистой культуры лептоспир 3—4 мл исследуемого материала вводят внутрибрюшинно морской свинке. Через 10—15 минут у нее берут кровь из сердца и засевают на бессывороточную питательную среду.
При посеве крови больного в 80% случаев наблюдается положительный результат.
Серологическая диагностика лептоспирозов основана на обнаружении агглютининов, лизинов и комплементсвязывающих антител в сыворотке больных (со 2-й недели заболевания). Реакция агглютинации — лизиса ставится следующим образом. Исследуемую сыворотку разводят от 1 : 50 до 1 : 10 000 и разливают по 0,2 мл (четыре капли) в небольшие агглютинационные пробирки, поставленные в несколько рядов (по числу серологических типов лептоспир, с которыми ставится реакция). Во все пробирки каждого ряда добавляют равное количество живой культуры, лептоспир определенного типа L. ictefohaemorrhagiae, L. Kazan., L. Weil- L. canicola, L. batavia, L. grippotyphosa, L. DBA, L. kasachstanica I и др.
В контрольные пробирки вместо сыворотки наливают 0,2 мл физиологического раствора и 0,2 мл культуры лептоспир. Пробирки встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 25—30°. Из каждой пробирки готовят препарат «раздавленной» капли и микроскопируют в темпом поле.
Рис. 109. Реакция агглютинации и лизиса лептоспир.
1 — контроль- 2 — агглютинация лептоспир- 3 — начало лизиса — зернистый
распад.
При наличии в сыворотке антител в первых разведениях наблюдается лизис: полное растворение лептоспир, частичный лизис или зернистое набухание. В последующих разведениях обнаруживают агглютинацию— скопление лептоспир в виде «паучков» (рис. 109). Диагностическое значение имеет положительная реакция в разведении сыворотки 1 :400.
При постановке реакции связывания комплемента сыворотку больных разводят 1 : 10, 1 : 100. Антигеном служит культура лептоспир или их аутолизат.
Для биологической пробы 3 мл крови больного в лихорадочном периоде, 5—10 мл мочи или спинномозговой жидкости, 1 мл взвеси органов из трупа человека или животного вводят морской свинке внутрибрюшинно. Картина заболевания и результаты вскрытия погибшей морской свинки описаны выше.
Лечение и профилактика. Лечение лептоспйрозов проводится пенициллином. Рекомендуется применение сыворотки иммунизированной лептоспирами лошади или сыворотки выздоравливающих.
К профилактическим мероприятиям общего характера относится: оздоровление местностей, эндемичных по инфекционной желтухе, увеличение кислотности почвы и дератизация. Специфическая профилактика заключается в применении вакцины, включающей в себя убитые нагреванием лептоспиры 3 типов (иктерогеморрагия, гриппо-тифоза и Монакова).
