Лабораторная диагностика туберкулеза - фтизиатрия
9.4. Лабораторная диагностика туберкулеза
Наиболее характерные изменения в анализах крови. Основными причинами изменений состава крови у больных туберкулезом являются интоксикация и гипоксия.
У больных с начальными формами туберкулеза в крови содержится нормальное количество эритроцитов и гемоглобина. По мере нарастания патологических изменений в легочной ткани нарушается газообмен, в результате чего у больных туберкулезом может развиться гиперхромная анемия (увеличение количества гемоглобина при уменьшенном количестве эритроцитов). При резком исхудании больного могут наблюдаться явления гипохромной анемии, которая характеризуется уменьшением количества эритроцитов и гемоглобина. Белая кровь более часто подвергается изменениям. При начальных фазах инфильтрата, обострениях очагового, хронического, диссеминированного и кавернозного процесса, при казеозной пневмонии может наблюдаться лейкоцитоз в пределах 12 000 — 15 000. При всех остальных формах туберкулеза, если нет сопутствующих заболеваний, количество лейкоцитов редко бывает выше нормы. Более характерен нейтрофильный сдвиг влево, который наблюдается при начальных формах и обострении туберкулезного процесса. Появляются палочкоядерные и даже юные нейтрофилы. Количество эозинофилов может увеличиваться у некоторых больных при антибактериальной терапии, а также при сопутствующих аллергических заболеваниях.
Тяжелые формы туберкулеза протекает с эозинопенией и лимфопенией. Лимфопения характерна для казеозных форм бронхоаденитов, казеозной пневмонии, милиарного туберкулеза. При малых и свежих формах туберкулеза обычно наблюдается лимфоцитоз.
Повышенная СОЭ зависит от процесса туберкулеза, только при туберкулезном менингите она гложет быть в пределах нормы.
Обнаружение микобактерий.
Обнаружение микобактерий имеет решающее значение не только для диагностики туберкулеза, оно чрезвычайно важно при прогнозировании течения процесса, выборе рациональной схемы лечения и правильной оценке его эффективности.
Основными методами лабораторной диагностики туберкулеза являются классические микробиологические методы: бактериоскопия- культуральное исследование, или посев- биологическая проба на чувствительных к туберкулезной инфекции лабораторных животных.
Сбор материала для исследования. Соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала имеет очень важное значение, так как от этого зависит не только достоверность получаемых результатов, но и эпидемиологическая безопасность окружающих.
Материал для исследования на наличие микобактерий туберкулеза собирают в стерильные контейнеры (стеклянные банки) с плотно завинчивающимися крышками. Применение герметичных контейнеров преследует двоякую цель: предотвращение просачивания содержимого и загрязнения окружающей больного среды чрезвычайно стойкими к физическим воздействиям микобактериями- изоляцию сохраняющегося в контейнере исследуемого материала от широко распространенных вегетирующих в окружающей среде кислотоустойчивых бактерий.
Для исследования может быть использован разнообразный патологический материал: мокрота, аспират, содержимое бронхов и другие материалы, получаемые при бронхоскопическом исследовании, промывные воды бронхов и желудка, экссудаты, гной, отделяемое ран, спинномозговая жидкость, кровь, моча, операционный материал, смывы с предметов, органы экспериментальных животных и пр.
У больных с легочными формами процесса объектом исследования чаще служит мокрота. Сбор мокроты — весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкого проведения которого во многом зависит результат исследования. В связи с этим желательно, чтобы сбор мокроты производился в отдельной (кашлевой), хорошо вентилируемой комнате. Для исследования собирают утреннюю порцию. Если больной выделяет мало мокроты, ее следует собирать в течение суток, при этом обязательно собранный материал хранить в холодильнике. Если исследование производится на фоне лечения, за 2 сут до сбора мокроты прием противотуберкулезных препаратов отменяется.
Согласно рекомендациям, разработанным Международным союзом по борьбе с туберкулезом, сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии среднего медицинского персонала. При этом лицам, ответственным за сбор мокроты, следует руководствоваться следующими правилами.
Видео: Мединар "Проблемы детского туберкулеза сегодня"
- Объяснить больному причины исследования и необходимость откашливать содержимое глубоких отделов дыхательных путей, а не собирать в контейнер слюну или носоглоточную слизь. Необходимо также предупредить больного, что он должен предварительно почистить зубы и прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть микрофлоры, вегетирующей в ротовой полости.
- Присутствующий при сборе мокроты медицинский работник должен открыть стерильный контейнер, снять с него крышку и передать больному только донную часть контейнера.
- Стоя позади больного, следует рекомендовать ему держать контейнер как можно ближе к губам и сразу же сплевывать в него мокроту по мере ее откашливания.
- По завершении сбора мокроты медицинский работник должен оценить ее количество и качество- контейнер с порцией мокроты достаточного объема (не менее 3 — 5 мл), содержащей уплотненные или гнойные комочки без слюны, тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, маркируют и помещают в специальный ящик для транспортировки в лабораторию.
Если больной не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и в скудном количестве, то накануне и рано утром в день сбора мокроты больному следует дать отхаркивающее средство или применить раздражающие аэрозольные ингаляции. Последние провоцируют усиление секреции бронхов, кашель и отделение мокроты.
Для аэрозольных ингаляций пользуются портативными аэрозольными ингаляторами типа АИ-1. В качестве ингалируемой смеси рекомендуется 15%-й раствор хлорида натрия в 1%-м растворе бикарбоната натрия (150 г NaCl и 10 г NaHCО3 на 1 л дистиллированной воды).
Если при раздражающей ингаляции почему-либо не удается получить мокроту, то используют промывные воды бронхов или желудка. Последний метод применяется преимущественно у детей младшего возраста, которые плохо откашливают мокроту и часто заглатывают ее.
Сбор промывных вод бронхов производится врачом-отоларингологом. Промывные воды желудка берут натощак с помощью толстого зонда, предварительно дав больному выпить или введя через зонд 100 — 150 мл раствора бикарбоната натрия (питьевой соды) в целях нейтрализации кислой реакции желудочного содержимого. Промывные воды желудка должны исследоваться немедленно, чтобы исключить повреждающее воздействие на возбудителя желудочных ферментов.
Более ценным материалом для исследования при отсутствии мокроты являются аспираты из трахеи и бронхов, бронхоальвеолярная лаважная жидкость, а также материалы прицельной катетеро- и щеточной биопсии, получаемые при бронхологических исследованиях.
Исследование кала на микобактерии необходимо производить при наличии признаков туберкулеза кишечника. У бактериовыделителей, которые частично заглатывают мокроту, микобактерии туберкулеза могут обнаружиться в кале и при непораженном кишечнике. При туберкулезе кишечника в кале нередко обнаруживаются слизь, кровь и даже примесь гноя. Для исследования берут несколько комочков кала со слизью или гноем, размешивают с 5%-м изотоническим раствором хлорида натрия и фильтруют. Полученный фильтрат смешивают с равным количеством этилового спирта и центрифугируют. В дальнейшем из осадка делают мазок, который окрашивают по методу Циля—Нильсена. В настоящее время туберкулез кишечника встречается исключительно редко, а поэтому исследование кала на БК практически не производится.
Обнаружение микобактерий в спинномозговой жидкости свидетельствует о туберкулезном менингите. Однако следует помнить, что бактериоскопическим методом удается выявить микобактерии лишь у 10 — 15 % больных туберкулезным менингитом.
Для исследования пробирку со спинномозговой жидкостью ставят в вертикальное положение на 8 — 10 ч в прохладном месте. Если в ней образуется фибринная пленка, она адсорбирует форменные элементы и микобактерии. Фибринную пленку помещают на предметное стекло и приготавливают препарат с окраской по Цилю — Нильсену. Если пленка не выпадает, препарат приготавливают из центрифугата.
Для обнаружения микобактерий в плевральном экссудате, в пунктатах и отделяемом из свищей препарат приготавливают так же, как и при исследовании мокроты.
Экссудаты из плевральной полости, отделяемое ран, аспираты и пунктаты из закрытых натечников, гнойных очагов, асцитическая жидкость и другие материалы должны быть взяты у больного с соблюдением всех правил асептики, помещены в стерильную посуду и доставлены в лабораторию.
Особого методического подхода требует исследование менструальной крови. Наличие в этом материале большого количества протеолитических, фибринолитических и других ферментов требует незамедлительной доставки материала в лабораторию и тщательной его обработки, так как менструальная кровь является весьма благоприятной средой для микробной флоры.
Особого внимания требует сбор мочи. Для исследования используют обычно среднюю порцию утренней мочи, полученной после тщательного туалета наружных половых органов растворами антисептиков (слабый раствор перманганата калия, риванола и пр.). Мочу центрифугируют, осадок используют для микроскопии и обрабатывают 3 —5%-м раствором серной кислоты, но не щелочью. Сбор суточной мочи для бактериологического исследования малорационален. Установлено, что при хранении мочи более 1 ч после сбора число микробных клеток неспецифической микрофлоры увеличивается в несколько раз. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать рост микобактерий.
Хранение, консервация и транспортировка диагностического материала. В противотуберкулезных учреждениях функционируют специализированные лаборатории, производящие бактериологические исследования.
В стационарах стерильные контейнеры с мокротой или другим патологическим материалом доставляются непосредственно в лабораторию. Сбор материала от амбулаторных больных производится, как указано выше, под непосредственным наблюдением среднего медицинского работника.
Если в лечебном учреждении не проводятся исследования для выявления кислотоустойчивых микобактерий, собранный диагностический материал должен централизованно доставляться в лабораторию. Обычно такая доставка осуществляется один или два раза в неделю. Следовательно, материал должен накапливаться в течение нескольких дней. Для этого используют биксы или специальные транспортировочные ящики, вмещающие 10 — 20 контейнеров, которые хранятся в холодильнике.
Во время транспортировки материал необходимо предохранять от воздействия прямых солнечных лучей и тепла. Если транспортировка и хранение занимают не более 48 ч, материал можно пересылать без консерванта. В летний период и в районах с теплым климатом консервация необходима, если транспортировка занимает более 24 ч. В этих целях можно применять 2 —3%-й раствор борной кислоты в соотношении 1 :1 или глицерин. В качестве консерванта можно также использовать 10%-й раствор трехзамещенного фосфата натрия или 0,05 —0,1%-й раствор хлоргексидин биглюконата в соотношении 1 : 1- в этих случаях посев материала производят без последующей обработки. Рост микобактерий может быть получен даже после хранения мокроты с консервантом при температуре 30 "С в течение 10—12 дней.
В условиях Крайнего Севера диагностический материал при длительной транспортировке может подвергаться воздействию значительных колебаний температуры. При этом необходимо учитывать, что допускается пересылка материала в замороженном состоянии без консерванта. Это обеспечивает сохранение жизнеспособности микобактерий в течение 8—15 дней, однако ни в коем случае нельзя допускать повторное оттаивание и замораживание материала, которые способствуют снижению жизнеспособности микобактерий.
Бактериоскопическое исследование. Оно является одним из основных и наиболее распространенных методов. Преимущества его заключаются в простоте, дешевизне и быстроте получения результатов. Однако возможности метода ограничены. В препарате можно обнаружить единичные микобактерии, если в 1 мл материала содержится не менее 10 000 — 100 000 бактериальных клеток (предел метода).
Наиболее распространенным методом окраски для выявления кислотоустойчивых микобактерий является способ Циля — Нильсена. Мокроту на предметном стекле окрашивают карболовым фуксином, при одновременном воздействии нагревания обесцвечивают мазок в 3%-м растворе солянокислого спирта (приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур) и докрашивают метиленовым синим. Только микобактерии, обладающие выраженной кислото- и спиртоустойчивостью, стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в красный цвет. Микобактерии обнаруживаются в препарате в виде тонких, прямых или слегка изогнутых ярко-красных палочек.
Микроскопию окрашенных препаратов производят в световом микроскопе с иммерсионным объективом х90 и окуляром х10 (увеличение х900).
В настоящее время применяется метод окраски люминисцентными красителями. Сравнительные исследования показали значительно более высокую информативность люминесцентного метода, которая, по данным различных авторов, колеблется от 9 до 19%.
В тех случаях, когда в патологическом материале не удается обнаружить микобактерии методом бактериоскопии, производят бактериологическое исследование. Культуральный метод — посев материала на питательные среды. Преимущество метода в высокой чувствительности. Достаточно 20—100 микобактерий в 1 мл материала. Недостаток метода заключается в длительности роста колоний: 1 — 3 мес.
Применение двух методов в совокупности позволяет более точно количественно оценить степень бактериовыделения.
Материал высевают на питательные среды и выделяют культуру микобактерии в чистом виде для дифференциации ее от кислотоустойчивых сапрофитов. Преимущество бактериологического метода по сравнению с бактериоскопическим заключается в том, что при наличии в патологическом материале жизнеспособных микобактерий можно диагностировать бацилловыделение. Недостатком метода является медленный рост микобактерии.
Исследуемый материал высевают на специальные среды после предварительной обработки. Наиболее часто используют яичные среды (Петраньяни, Левенштейна, Гельберга), которые содержат краски, тормозящие рост других бактерий. В отдельных случаях применяются посевы на жидкие питательные среды, а также производится микрокультивирование на стеклах.
Предварительная обработка патологического материала сводится к уничтожению сопутствующей флоры. Посев промывных вод желудка, бронхов, а также мочи производится из центрифугата или осадка. При этом мочу, если она не загрязнена, можно не обрабатывать. Промывные воды желудка необходимо нейтрализовать 10 — 15%-м раствором гидрокарбоната натрия, так как под влиянием желудочного сока через 6 ч снижается жизнедеятельность микобактерий. Специальной обработки здесь также не требуется.
Существует несколько методов предварительной обработки плеврального экссудата и мокроты. Для примера опишем методы Мазура и Петрова. В стерильную пробирку заливают 3 — 4 мл 2%-го раствора серной кислоты, туда же помещают часть патологического материала. Пробирку встряхивают в течение 3 мин, после чего стерильной платиновой петлей производят посев на яичные среды (метод Мазура).
Метод Петрова заключается в том, что материал заливают 4%-м раствором едкого натра и ставят в термостат на 1 ч, после чего образовавшуюся гомогенную смесь нейтрализуют 4%-м раствором соляной кислоты. Среду контролируют лакмусовой бумажкой. Осадок нейтральной жидкости засевают в пробирки на яичные среды.
Яичная среда ставится в термостат при температуре 37 °С. Первые колонии микобактерий появляются на 18 —30-й день, а иногда и через 3 месяца.
Бактериологическое и бактериоскопическое исследование необходимо проводить в сочетании. Если при бактериоскопии микобактерии не обнаружены, а при посеве наблюдается их рост, то это означает, что больной выделяет небольшое количество микобактерий туберкулеза. В случаях, когда при бактериоскопии микобактерии обнаруживаются, а результаты посева отрицательны, то это свидетельство того, что больной выделяет кислотоустойчивые бактерии пониженной жизнеспособности или же погибшие микобактерии туберкулеза.
Биологический метод заражения животных сейчас применяется только в научно-исследовательских институтах.
Прививка патологического материала животным производится в паховую область в дозе 2 — 3 мл.
В настоящее время началось использование молекулярно-биологического метода гибридизации ДНК, или, по-другому, полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сначала выделяется ДНК микобактерии, затем она клонируется и идентифицируется. Метод очень чувствительный (достаточно 1 МБТ), однако без одновременной оценки клинической картины заболевания использовать
его надо осторожно. Он не различает мертвые МБТ, штамм БЦЖ и может выявить случайно попавшие микробы. Это — перспективный метод, но его роль еще до конца не определена.
Определение лекарственной устойчивости микобактерий.
В настоящее время разработаны и внедрены в практическую деятельность диспансеров методы определения лекарственной чувствительности (устойчивости) микобактерий к туберкулостатическим препаратам. Различают первичную лекарственную устойчивость у больных, не леченных противотуберкулезными препаратами, и вторичную, развивающуяся в процессе лечения. Частота первичной устойчивости составляет 20 —80 %.
Наиболее распространен метод серийных разведений абсолютных концентраций туберкулостатических препаратов на питательных средах.
Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза определяется прямым и непрямым методами.
Прямой метод заключается в посеве обработанного материала (мокроты, промывных вод бронхов, гноя), содержащего микобактерии туберкулеза, на плотную среду Левенштейна—Иенсена или Гельберга, содержащую лекарственные препараты. Этот метод может быть применен, когда микобактерии в материале обнаруживаются в значительном количестве (1 — 5 микробных тел в поле зрения).
Непрямой метод сводится к тому, что сначала получают культуру в чистом виде, а затем для определения лекарственной устойчивости производят посев. Поэтому результат исследования при прямом методе получают раньше — через 15 — 20 дн, при непрямом — через 3 — 4 нед. или 2 — 3 мес.
Питательные среды Левенштейна —Иенсена для определения лекарственной устойчивости готовят с добавлением туберкулостатических препаратов различных концентраций, т.е. методом серийных разведений. Кроме того, чтобы избежать прорастания посторонней флоры, добавляют 10ЕД пенициллина на 1 мл среды.
Этим способом определяют концентрацию туберкулостатического препарата, при которой еще наблюдается рост микобактерий туберкулеза, и концентрацию, при которой рост микобактерий не происходит.
Лекарственная устойчивость микобактерии может быть: моно — к одному препарату, множественная — к смеси изониазида и рифампицина, полирезистентная — к двум и более препаратам кроме рифампицина и изониазида, перекрестная — к препаратам со сходной химической структурой.
В настоящее время внедряются генетические методы определения лекарственной устойчивости с помощью ПЦР-метода.
Видео: Оценка риска трансмиссии туберкулеза и разработка плана инфекционного контроля
В практику лечебно-диагностических учреждений внедрено также определение степени инактивации изониазида. Степень инактивации изониазида определяется исследованием мочи. За 3 дня до исследования больному отменяют назначение всех препаратов, кроме изониазида, его продолжают назначать в обычной дозе. Затем утром ему дают тест-дозу (0,6 г) изониазида.
У сильных инактиваторов с мочой выделяется 10%, у средних — 14 и у слабых 40 % изониазида.
