Методы определения иммунологической реактивности - практические навыки педиатра
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
В педиатрической практике широко используются аллергологические кожные пробы с микробными и немикробными антигенами, туберкулиновые пробы, исследование белковых фракций и иммуноглобулинов сыворотки крови, слизи верхних дыхательных путей и других экскретов, ставятся реакции агглютинации, преципитации, иммунофлуоресценции, реакция связывания комплемента (РСК), реакция Кумбса, проводятся исследования неспецифических факторов защиты — С-реактивного белка, интерферона, пропердина, комплемента и пр. Для ориентировки изложим принципы некоторых наиболее часто используемых иммунологических исследований.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИЦИФИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ
Гемолитическая активность комплемента. Комплемент (син. алексин) —это неспецифический фактор защиты, в систему которого входит ряд сывороточных белков. По номенклатуре ВОЗ система комплемента обозначается символом С, а ее индивидуальные компоненты — цифрами от 1 до 9 (Ci, С2, С9). В системе комплемента 8 белков являются индивидуальными, а Сд представляет собой комплекс, в который входят 4 белка системы пропердина, 1 ингибитор фермента и 2 фермента. Белки системы комплемента могут быть активированы в определенной последовательности по принципу биологического усиления при реакции антиген — антитело или неспецифическими факторами (С3-проактиватор, С-проактива-торконвертаза, фактор кобры и др.). Сыворотка, подогретая до 56 °С, в течение 30 минут теряет комплементарную активность. Комплемент способен присоединяться к комплексу антиген — антитело, на чем основана РСК. Существует ряд модификаций РСК. Сниженный титр комплемента наблюдается при выраженной степени аллергизации организма, некоторых аутоиммунных заболеваниях (коллагенозах и др.).
Об уровне содержания комплемента в сыворотке крови судят по его гемолитической активности. Наиболее широко используется унифицированный метод определения гемолитической активности комплемента по 50 % гемолизу. В основу метода положен принцип, согласно которому комплемент исследуемой сыворотки вызывает гемолиз сенсибилизированных бараньих эритроцитов в присутствии сыворотки кролика, иммунизированного бараньими эритроцитами (гемолитическая сыворотка). Активность комплемента учитывается в условных гемолитических единицах. Одна 50 % гемолитическая единица — это такое количество комплемента, которое вызывает гемолиз 50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибилизированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин. В сыворотке здоровых людей содержится 20—40 гемолитических единиц комплемента.
Пропердин. Относится к неспецифическим иммунным факторам организма. В присутствии комплемента и ионов магния пропердин проявляет бактерицидное действие и способен инактивировать некоторые вирусы. В сыворотке крови человека в норме содержится 4—8—10 ед. пропердина.
Для определения уровня пропердина в сыворотке крови применяют зимозановый метод титрования. Он основан на способности пропердина связываться с полисахаридом зимозаном. Образующийся при этом комплекс пропердин — зимозан инактивирует третью фракцию комплемента (Сз). Учет результатов производят по степени инактивации Сз.
Определение С-реактивного белка. В сыворотке крови здоровых людей С-реактивный белок не определяется. Он обнаруживается при остром воспалительном процессе, заболеваниях, сопровождающихся тканевой деструкцией, и является показателем активности этих процессов.
В стеклянный капилляр размером 0,4 X 100 мм набирают до 1/3 объема антисыворотки и такой же объем сыворотки больного. Покачивая капилляр 12—15 раз, содержащиеся в нем реагенты перемешивают. Затем капилляр удерживают в горизонтальном положении и конец его погружают в пластилин таким образом, чтобы при придании капилляру вертикального положения смесь находилась над столбиком воздуха, не прикасаясь к пластилину. Реакция может происходить при комнатной температуре, в таком случае предварительный учет результатов производится через 4 ч, а если смесь инкубируется в термостате при температуре 37 °С — через 2 ч. Окончательный результат учитывают после выдерживания смеси сыворотки в капилляре при комнатной температуре 18—20 ч, т. е. в конце суток. На наличие С-реактивного белка указывает выпадение преципитата: высота осевшего преципитата в
- мм оценивается одним крестом ( + ), в 2 мм — ( + + ). в
- мм — ( + + + )» в 4 мм и более — ( + + + + ).
Титр гетерофильных агглютининов. К факторам естественного неспецифического иммунитета относятся гетерофильные агглютинины, которые образуются в ответ на спонтанное воздействие на организм широко распространенных в окружающей среде антигенов. Титр гетерогенных агглютининов в сыворотке крови зависит от возраста: в первые 5 лет жизни он нарастает, а в старости — падает. У здоровых взрослых людей титр гетерофильных агглютининов колеблется в разведениях от 1:8 до 1:32 (в среднем 1:16). Титр определяются по методике Пауля — Буннеля.
Лизоцим. Это — один из врожденных факторов противомикробной защиты, обнаруживаемый в слезной жидкости, мокроте, коже, сыворотке крови, молоке, почках, печени, сердце и других тканях организма человека. Особенно богаты этим веществом лейкоциты и слезная жидкость. Впервые лизоцим был обнаружен А. Флемингом (1922). Исследованиями 3 В. Ермольевой с сотр. (1968) было показано, что лизоцим представляет собой фермент мурамидазу, разрушающий пептидополисахариды клеточных стенок бактерий.
Существует несколько методов определения активности лизоцима биологический, путь серийных разведений с тест-микробом, турбодиметрический и метод диффузии на агаре.
Согласно литературным данным (3. М. Михайлова, П. А Михеев, 1966), у детей первых лет жизни и новорожденных титр лизоцима значительно выше, чем у взрослых.
Фагоцитарная активность лейкоцитов. Явление фагоцитоза как важнейший фактор естественного иммунитета было открыто И. М. Мечниковым. Способностью поглощать и переваривать микроорганизмы и другие чужеродные частицы обладают в крови нейтрофилы (микрофаги), моноциты и клетки ретикулоэндотелиальной системы (подвижные и фиксированные макрофаги).
В видалевской пробирке готовится смесь, в которую входят 0,1 мл лимоннокислого натрия в 2 % растворе, 0,2 мл исследуемой крови и 0,1 мл взвеси тест-микроба (стафилококк № 209 или др.), полученной из суточной агаровой культуры и разведенной до 400 млн микробных тел в 1 мл. После перемешивания перечисленных компонентов смесь помещают в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем смесь центрифугируют, из верхнего слоя осадка готовят мазки, фиксируют их смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому— Гимзе. Препарат микроскопируют, выраженность фагоцитоза оценивают по количеству поглощенных нейтрофилами микробов (фагоцитарное число) и количеству лейкоцитов, проявивших фагоцитарную активность. С этой целью просматривают 100 нейтрофилов. В норме у здоровых людей фагоцитирующие лейкоциты составляют 50—70 %, а фагоцитарное число — 2—4.
Реакция бласттрансформации (РБТ) лимфоцитов. Это способность лимфоцитов превращаться в недифференцированные бластные клетки при культивировании лейкоцитов in vitro на искусственной питательной среде. Такой процесс может быть стимулирован специфическими и неспецифическими агентами. Неспецифическим стимулятором является растительный белок фитогемагглютинин, под влиянием которого через 72 ч происходит трансформация лимфоцитов в большие зародышевые клетки, причем многие из них находятся в состоянии мейоза.
В работах многих исследователей было показано, что при тяжелом течении ряда заболеваний РБТ лимфоцитов, полученных у таких больных, резко угнетена. При улучшении состояния больных восстанавливается способность лимфоцитов превращаться под действием стимулятора в бластные клетки.
