Исследование липидного обмена - практические навыки педиатра
Физиологическая роль липидов многогранна. Они образуют липидную матрицу структурных элементов клеток и их органелл, участвуют в энергетическом обмене, служат исходным материалом для синтеза стероидных гормонов, соединений, обладающих свойствами витамина D, играют важную роль в свертывании крови, иммунологических процессах, пищеварении. Производными липидов (полиеновых кислот) являются простогландины — соединения, характеризующиеся высокой биологической активностью и выполняющие в организме различные функции.
Главные липидные компоненты крови: фосфолипиды, свободный и эфиросвязанный (эфиры холестерина) холестерины, триглицериды (нейтральные липиды), неэстерифицированные жирные кислоты, ряд продуктов промежуточного обмена.
Плазменные липиды первично в воде нерастворимы. Они транспортируются в крови в виде липопротеидов. Эти агрегаты состоят из специфических апопротеинов и представителей класса липидов: триглицеридов, холестерина, эфира холестерина и фосфолипидов.
Для оценки состояния липидного обмена в клинике определяют общие липиды и отдельные липидные фракции крови, липопротеиды сыворотки (плазмы), кетоновые тела в крови и моче, активность панкреатической и постгепариновой (липопротеиновой) липазы, а также лецетин- холестерин-ацилтрансферазы, проводят нагрузочные пробы жирами, углеводами, пробу с липоидолом, изучают липидный спектр кала, используют изотопные методы исследования.
Для определения общих липидов сыворотки крови широко применяется метод, разработанный Целнером и Кирш (1962). Основан этот метод на реакции липидов с так называемым сульфо-фосфованилиновым реактивом. Метод высоко чувствителен, технически прост, дает достаточно воспроизводимые результаты. Наиболее удобным вариантом из существующих методов, основанных на сульфо-фосфованилиновой реакции, является модификация, разработанная Ю А. Барышниковым, Ю. Е. Вельтищевым и др. (1966).
Определение общих липидов в сыворотке с помощью сульфофо-сфованилиновой реакции. В основе метода лежит цветная реакция продуктов распада ненасыщенных липидов с сульфо-фосфованилиновым реактивом.
К 0,01 мл сыворотки добавляют 0,4 мл концентрированной серной кислоты и ставят на водяную баню при 100 °С на 20 мин. После охлаждения к смеси прибавляют 1,6 мл фосфорно-ванилинового реактива (0,6% раствор ванилина в концентрированной фосфорной кислоте в соотношении 1:4) и встряхивают. Через час пробу фотометрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре в 3 мм кювете против контроля (0,01 мл дистиллированной воды, обработанной так же, как и сыворотка).
Табл. 50. Липидные фракции сыворотки крови у детей.
Возраст | Липиды общие, г/л | Холестерин, ммоль/л | Эфиры холестерина, ммоль/л | Процент эфиров от общего холестерина | Фосфолипиды, | Три глицериды, ммоль/л | |
общий | свобо-дный | ||||||
Ново-рожденные | 3,87 ± 0,53 | 2,67 ± 0,46 | 0,88 ± 0,93 | 1,79 ±0,366 | 66,4 ±7,6 | 0,79 ± 0,143 | 0,99 ±0,202 |
0—6 мес. | 5,99 ± 1,03 | 4,03 ± 0,73 | 1,04 ± 0,25 | 3,0 ±0,61 | 74,2 ± 5,0 | 1,72 ±0,32 | 1,45 ± 0,19 |
6—12 мес. | 6,27±0,64 | 4,08 ± 0,76 | 1,11 ±0,26 | 2,99 ± 0,60 | 72,9 ± 5,1 | 1,69 ± 0,29 | 1,56 ± 0,21 |
12 мес.— 2 года | 6,44±0,92 | 4,08 ± 1,1 | 1,13± 0,25 | 2,96 ± 0,29 | 72,4 ±6,0 | 1,66 ±0,32 | 1,96 ± 0,26 |
2—5 лет | 6,82 ± 1,02 | 3,96 ± 0,79 | 0,83 ± 0,178 | 3,14 ±0,64 | 79,1 ±9,2 | 1,78±0,18 | 1,43 ± 0,23 Видео: Лекция 4 Ферменты Кинетика, ингибирование, изоферменты |
5—10 лет | 6,80 ± 0,30 | 4,6 ±0,93 | 1,15 ± 0,23 | 3,18 ± 0,83 | 63,6 ±5,6 | 1,84 ±0,36 | 1,41 ±0,23 |
10—15 лет | 6,60 =+: 0,19 | 4,61 ±0,72 | 1,51 ±0,27 | 3,1 ±0,57 | 67,2±4,9 | 2,21 ±0,44 | 1,25 ± 0,46 |
Содержание общих липидов рассчитывают по калибровочному графику, полученному со стандартными растворами триолеина, или определяют по формуле
где С — концентрация стандартного раствора, г/л.
Если реакцию с триолеином принять за 100 %, то равные количества других липидов составят: холестерин — 91 % экстинции, линолевая кислота — 77,5, фосфолипиды — 53,7 и стеариновая кислота — 19 %.
Уровень общих липидов в пуповинной крови самый низкий. В течение первых недель жизни содержание липидов в сыворотке крови быстро повышается и колеблется от 5,99 до 6,82 г/л (табл. 50).
Повышение липидов в сыворотке крови (гиперлипемия) наблюдается при сахарном диабете, панкреатитах, острых и хронических гепатитах, ожирении, острых и хронических нефритах с отеками, экссудативном диатезе, токсикозах- снижение (гиполипемия) — при гипотрофии, гипертиреозе, диареях, остром некрозе печени.
Определение общего холестерина.
Общий холестерин представляет собой сумму свободного и эстерифицированного холестерина. В качестве унифицированных утверждены прямой метод Илька, основанный на реакции Либермана — Бурхарда, и прямой метод, основанный на реакции Златкиса — Зака. Наиболее широко используется метод Илька. В основе этого метода лежит следующий принцип: холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание.
Техника определения такова. К 2,1 мл реактива Либермана— Бурхарда (1 часть ледяной уксусной кислоты, 5 частей уксусного ангидрида и 1 часть концентрированной серной кислоты) медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Пробирку энергично встряхивают 10—12 раз, затем термостатируют 20 минут при 37 °С и колориметрируют против реактива Либермана — Бурх арда на ФЭКе при красном светофильтре в 5 мм кювете. Содержание общего холестерина рассчитывают по калибровочному графику, построенному по разведениям стандартного раствора холестерина. Нормальные значения холестерина у детей колеблются от 2,67 до 4,61 ммоль/л (см. табл. 50).
Гиперхолестеринемия часто наблюдается при нефротическом синдроме, микседеме, сахарном диабете, гликогенной болезни, атеросклерозе, ксантоматозе, заболеваниях печени и желчных путей, особенно при нарушениях оттока желчи.
Важное значение для дифференциальной диагностики застойной и паренхиматозной желтух имеет исследование фракций холестерина. При механических желтухах возрастает уровень либо одного свободного холестерина, либо свободного и этерифицированного. Для гепатитов характерно снижение эфиров холестерина, пропорциональное степени нарушения функции печени. Увеличение эфиров холестерина в динамике болезни говорит об улучшении процесса, уменьшение — об ухудшении. В норме коэффициент этерификации холестерина (отношение эфиров холестерина к общему холестерину) у детей составляет 0,6—0,8. При поражении паренхимы печени он может уменьшаться до 0,4—0,2 и даже 0,15.
Гипохолестеринемия наблюдается при тяжелых паренхиматозных поражениях печени, печеночной коме, аддисоновой болезни, острых панкреатитах, расстройствах питания, врожденных гемолитических анемиях и др.
Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови. Содержание фосфолипидов определяют по концентрации липидного фосфора, на долю которого приходится 4 % относительной молекулярной массы (метод Блюра).
В качестве унифицированного предложен метод определения общих фосфолипидов сыворотки по содержанию общего фосфора в липопротеидах, осаждаемых трихлоруксусной кислотой (В Г. Колб, В. С. Камышников, 1976). Метод основан на следующем принципе: фосфолипиды осаждаются трихлоруксусной кислотой (вместе с белками крови), в полученном осадке определяется содержание фосфора.
Нормальные значения фосфолипидов в сыворотке крови у детей колеблются от 0,79 ммоль/л у новорожденных до 2,21 ммоль/л у детей старшего возраста (см. табл. 50).
Повышение содержания фосфолипидов в сыворотке крови может наблюдаться в начальном периоде гепатита, при застойной желтухе, хроническом нефрите, тяжелой форме сахарного диабета, портальном циррозе, эссенциальной гиперлипемии, постгеморрагических анемиях, На типе гиперлипопротеидемий. Снижение концентрации фосфолипидов отмечается при поражениях печени — вирусном и токсическом гепатите в разгар заболевания, постнекротическом циррозе и особенно жировой дистрофии печени, при атеросклерозе, различных формах анемий, острых лихорадочных состояниях, алиментарной дистрофии, гипотиреозе и др.
Тонкослойная хроматография липидов. Проводится на тонком слое силикагеля — наиболее эффективный высокочувствительный метод, применение которого позволяет одномоментно исследовать липидный спектр в очень малых объемах крови. Для количественной оценки хроматограммы липидов используются два способа: 1) обнаружение липидных фракций на пластине, их идентификация, удаление вместе с сорбентом и жидкостное элюирование. Количественное определение извлеченных фракций можно проводить при помощи специфических и неспецифических химических реакций- 2) прямая денситометрия на пластине липидных фракций, окрашенных фосфорномолибденовой кислотой (Л. А. Ахрем, А. И. Кузнецов, 1965). Разработан метод определения липидного спектра крови (В. С. Данильчик, 1977). Для определения 10—11 липидных фракций достаточно 0,02 мл пробы (плазмы или эритроцитов), которую можно взять из пальца.
Лабораторные методы определения липопротеидов. Наиболее прост и доступен турбодиметрический метод определения (3-липопротеидов по Бруштейну и Самай. Принцип основан на способности p-липопротеидов сыворотки крови осаждаться под влиянием кальция в присутствии гепарина при той или иной реакции среды (В. Г. Колб, В. С. Камышников, 1976).
