Экспресс-методы выявления наследственных биохимических дефектов - практические навыки педиатра
Известно около 500 наследственных заболеваний обмена веществ, которые могут нарушать нормальный рост и развитие ребенка. Диагностика этих заболеваний по внешним клиническим признакам не всегда возможна. Программы биохимических исследований для выяснения сущности наследственного дефекта обмена веществ очень сложны, и проводить их можно лишь в специализированных генетических лабораториях. Однако в детских клинических и поликлинических лабораториях могут выполняться пробы первого этапа, помогающие врачу «отсеивать» (screening) детей с подозрением на наследственное заболевание обмена веществ. Поэтому такие экспресс-методы называют скринирующими пробами. Это преимущественно качественные пробы. Дети с положительными результатами по скринирующим пробам
обследуются в специализированных лабораториях при медико-генетических консультативных центрах по программе второго этапа. Для уточнения характера наследственного дефекта применяются хромосомный анализ, физические, биохимические, особенно хроматографические, методы исследования.
Приводим наиболее часто используемые в практической педиатрии пробы первого этапа.
Микробиологические методы диагностики. В ряде стран Европы и Америки используется тест Гатри. При этом в среду с культурой В. Subtilis добавляют ингибиторы, подавляющие рост микроба. При наличии в крови и моче у больных повышенного количества аминокислот (фенилаланина, лейцина, гистидина и др.) тормозящее влияние ингибиторов устраняется и зоны роста микроба увеличиваются.
В нашей стране с этой целью часто используют ауксотрофные штаммы В. Е. coli, К-12. В основе метода лежит стимуляция роста ауксотрофных мутантов повышенным количеством аминокислот, содержащихся в крови и моче.
Проба с 10 % раствором треххлористого железа (FeCt3). FeCb вступает в реакцию с фенилпировиноградной, иммидазолпировиноградной кислотами и другими соединениями. При этом происходит окрашивание раствора, характер и интенсивность которого указывают на особенности обменных нарушений.
Реактивы: 10% раствор FeCl3, 10% раствор НС1, магниевый реактив (11 г MgCh, 20 мл концентрированного NH4OH, 1 л дистиллированной воды).
Техника: к 4 мл мочи для связывания фосфатов добавляют 1 мл магниевого реактива, перемешивают и через 5 минут фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат подкисляют 2 каплями 10 % раствора НС1, после чего добавляют 3—4 капли 10 % раствора FeCh. В течение 5—7 минут отмечают изменение окраски.
При фенилкетонурии смесь принимает сине-зеленую окраску- тирозинозе — сине-зеленую, быстро выцветающую- гистидинемии — серо-зеленую- при нарушении абсорбции метионина — пурпурную, переходящую в красно-коричневую- алкаптонурии — зеленую, быстро выцветающую- диабете — красно-коричневую и т. д.
Проба Легаля на кетонные тела. Реактивы: 5% водный раствор натрия нитропруссида (готовят ex tempore), ледяная уксусная кислота, 10% раствор NaOH.
Т е х н и к а: к 1 мл мочи добавляют две капли 5 % раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл 10 % NaOH. Затем вводят 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь взбалтывают и учитывают характер окрашивания.
При наличии в моче ацетона, ацетоуксусной, р-оксимасляной кислот (кетоновые тела) введение нитропруссида дает вишнево-красное окрашивание, которое не исчезает, если добавить уксусной кислоты. Пробу считают положительной и при слабо-розовой окраске в условиях достаточного подкисления мочи.
Проба на кетокислоты с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ). Р е а кт и в ы: 0,2 % раствор 2,4-ДНФГ в 2 н. НС1, эфир, 10 % раствор На2СОз.
Техника: 0,25 мл мочи смешивают с 1 мл 0,2% раствора 2,4-ДНФГ, через 10 минут к смеси добавляют равный объем эфира, смешивают и отстаивают. После того как содержимое пробирки разделится на 2 слоя, верхний (эфирный) слой пипеткой переносят в чистую пробирку и добавляют равный объем 10 % раствора №гСОз.
В реакции 2,4-ДНФГ реагирует с кетокислотами мочи, вследствие чего образуются окрашенные гидрозоны. При положительной реакции нижний карбонатный слой окрашен в желтый или оранжевый цвет. Интенсивность окрашивания оценивается визуально по шкале от 0 до + + + +. При резко положительной пробе нижний слой имеет почти коричневую (темно-оранжевую) окраску, при отрицательной остается бесцветным.
Реакция бывает положительной при фенилкетонурии, болезни кленового сиропа, тирозинозе, или тирозинурии, гистидинемии. Подобное окрашивание может быть также при гиперглицинемии и гликогенозах типа 1, 3, 5, 6 за счет реагирования с ацетоном.
Проба на мукополисахариды с цетилтриметиламмо-ниумбромидом (ЦТАБ, или цетавлон). Реактивы: 2,5 % раствор ЦТАБ в 1 М цитратном буфере, pH 5,75 (перед растворением ЦТАБ буфер подогревают).
Методика приготовления цитратного буфера следующая: 1) растворяют 210 г лимонной кислоты (CeHeOzX X Н2О) в 500 мл дистиллированной воды- 2) добавляют 150 мл 20 н. NaOH, раствор перемешивают и охлаждают до комнатной температуры- 3) используя потенциометр, pH раствора доводят до 5,75 при комнатной температуре
с добавлением 2и. NaOH- 4) объем реактива путем добавления дистиллированной воды доводят до 1 л.
Техника: к 5 мл свежей мочи добавляют 1 мл 2,5 % раствора ЦТАБ, смешивают. Проба считается положительной, если в течение 20—30 минут появляется мутный или пушистый преципитат. Реакция бывает положительной при таких мукополисахаридозах, как синдромы Hurler Hunter, Sanfilippo, Scheie, а также при некоторых других наследственных и ненаследственных заболеваниях: синдроме Марфана, артрониходисплазии, множественных экзостозах, ревматоидном артрите, кретинизме и др.
Проба на мукополисахариды с толуидиновым синим.
Каплю мочи микропипеткой наносят на фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре, затем погружают в толуидиновый реактив на 1 минут и отмывают в 95 % растворе этанола. При положительной пробе пятно окрашивается в пурпурно-красный цвет. В качестве контроля параллельно ставят пробу с мочой больного гаргоилизмом или с раствором хондроинтинсульфата А в концентрации 2 мг/мл.
Нитрозонафтоловая проба на тирозинемию. Реактивы: 1) 2,63 н. азотная кислота, для ее приготовления один объем концентрированной азотной кислоты растворяют в 5 объемах воды- 2) NаNОз, 2,5 г которого растворяют в 100 мл воды- 3) а-нитрозо-в-нафтол, 100 мг которого растворяют в 100 мл 25 % раствора этанола. Все реактивы хранят в холодильнике.
Техника: к 1 мл 2,63 н. азотной кислоты добавляют каплю раствора NаNОз и 10 капель раствора а-нитрозо- b-нафтола. После смешивания указанных растворов добавляют три капли мочи и вновь смешивают. О положительном результате говорит оранжево-красное окрашивание, появляющееся в течение 3—5 мин. Такое окрашивание могут дать только тирозин и его метаболиты, что наблюдается при недостаточности трансаминазы тирозина и тирозинемии.
Проба на ацетон в моче. Проводится с помощью таблеток, содержащих натрия нитропруссид. Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде реагируют с нитрозогруппой натрия нитропруссида. При этом образуются комплексные анионы красно-коричневого цвета. По цветной шкале определяют количество ацетона в моче. Таблетки для экспресс-анализа мочи на ацетон имеются в наборе завода «Реагент». В набор входит также пипетка, цветная шкала и инструкция.
Проба с нингидрином на гипераминоацидурию. Реактивы: раствор 1 г нингидрина в 500 мл 95% раствора этанола, который хранят в темной стеклянной банке в холодильнике.
Техника: к 1 мл реактива добавляют три капли мочи и смешивают. Появление голубой или пурпурной окраски через 3—5 минут указывает на содержание в моче избыточного количества аминокислот. Возможны артефакты, что бывает при высококонцентрированной моче или большом содержании в ней аммония.
Проба Эрлиха на уробилиноген и порфобилиноген. Реактив: 2% раствор диметиламинобензоальдегида в 2 н. НС1.
Техника: к 5 мл мочи добавляют 1 мл реактива. При наличии уробилиногена и порфобилиногена через 10 минут появляется розовое окрашивание.
Пробу используют при подозрении на наследственное нарушение обмена билирубина.
Проба Селиванова на фруктозу. Реактив Селиванова: 0,5 % раствор резорцина в 20 % растворе НС1.
Техника: к 1 мл мочи добавляют 0,5 мл указанного реактива, смешивают и ставят в кипящую водяную баню на 1 мин, При наличии в моче фруктозы после кипячения с резорцином появляется вишнево-красное окрашивание. Однако, если смесь кипятить более длительно, подобное окрашивание может дать и присутствие глюкозы.
Пробу используют для выявления наследственной фруктоземии.
Проба Сулковича на кальций. Реактив Сулковича: 2,5 г щавелевой кислоты- 2,5 г аммония сульфата- 5 мл ледяной уксусной кислоты- 150 мл дистиллированной воды.
Техника: к 1 мл мочи в пробирку добавляют 1 мл реактива Сулковича и перемешивают. Через 1—2 мин, когда появляется мутность, пробу сравнивают с профильтрованной мочой того же ребенка. Степень помутнения оценивают визуально по шкале от 0 до + + ++.
Резко положительной проба Сулковича бывает при идиопатической гиперкальциемии.
Проба с ортотоллуидином на медь. Реактивы: 0,1 г ортотоллуидина- 0,5 г роданистого аммония- 5 мл ацетона.
Перед постановкой пробы перечисленные реактивы в указанных количествах смешивают.
Техника: две капли мочи наносят на тонкую фильтровальную бумагу и высушивают Затем на образовавшееся пятно наносят каплю свежеприготовленной смеси реактивов.
Проба считается положительной, если в течение 30 с появляется синяя окраска, что говорит об избыточном содержании в моче меди. Постановка пробы способствует выявлению больных гепатолентикулярной дегенерацией.
