Методы исследования функции печени - практические навыки педиатра
ИССЛЕДОВАНИЕ ПИГМЕНТНОЙ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ
Для характеристики функции печени важное значение имеет исследование показателей пигментного обмена: концентрации в сыворотке крови билирубина и его фракций, содержания билирубина и уробилиногена в моче.
В процессе образования билирубина из разрушающегося гемоглобина вначале в ретикулоэндотелиальных клетках, и прежде всего в купферовских клетках печени, образуется свободный пигмент (не связанный с глюкуроновой кислотой), трудно растворимый в воде (непрямой) билирубин. В печени под влиянием фермента глюкуронилтрансферазы свободный билирубин связывается с глюкуроновой кислотой. При этом образуется хорошо растворимый в воде (прямой) билирубин-диглюкуронид, который в составе желчи выделяется в кишечник. Под влиянием бактериальной флоры кишечника билирубин превращается в уробилиноген. Часть его окрашивает каловые массы и называется стеркобилином, другая часть всасывается в кишечнике и с током крови по воротной вене возвращается в печень, где вновь входит в состав желчи. Следы уробилиногена выделяются с мочой, и при соприкосновении его с внешним воздухом образуется уробилин.
Существует ряд методов количественного определения билирубина в сыворотке крови.
Метод Ван-ден-Берга. Основан на способности билирубина давать с диазореактивом красное окрашивание. Интенсивность окраски, определяемая колориметрически, пропорциональна содержанию билирубина в сыворотке крови. Этот метод позволяет определить: 1) прямой билирубин (водорастворимый билирубин-диглюкуронид), если сыворотка приобретает пурпурную окраску в течение 2 минут после прибавления диазотированной сульфаниловой кислоты (прямая быстрая реакция)- 2) непрямой (связанный с белками, неконъюгированный) билирубин, дающий окрашивание с диазореактивом после осаждения белка спиртом. При этом возможна прямая замедленная реакция, когда добавление диазореактива к сыворотке вызывает окрашивание в течение 10—12 мин. У здоровых людей наблюдается непрямая или прямая замедленная реак-
ция. Показатели непрямого билирубина при определении этим методом обычно занижены, так как часть пигмента удаляется вместе с осадком после добавления спирта. Более точные данные можно получить с помощью метода Ендрашика.
Метод Ендрашика — Келгорна. Базируется на том, что свободный и связанный билирубин в присутствии раствора кофеина диазотируется диазореактивом и сыворотка приобретает светло-красную окраску, интенсивность которой устанавливают колориметрически, сравнивая со стандартными растворами билирубина в хлороформе. Отделу но проводят прямую реакцию Ван-ден-Берга, определяя уровень билирубина, связанного с глюкуроновой кислотой. Содержание свободного (неконъюгированного) билирубина находят вычислением разницы между общим и связанным билирубином.
Метод Ендрашика— Грофа. Удобен при определении больших количеств (до 34 мкмоль/л) билирубина в мутных сыворотках. Этот метод отличается от описанного выше тем, что в реакцию вводится раствор Фелинга, превращающий азобилирубин в синее производное.
Содержание билирубина в сыворотке крови новорожденных, детей старшего возраста и взрослых представлено в табл. 37. Колебания в содержании билирубина в сыворотке крови у детей старшего возраста составляют 3,4—13,7 мкмоль/л.
Табл. 37. Изменения нормального содержания билирубина в сыворотке крови новорожденных и детей старшего возраста
Нормальные величины билирубина устанавливаются у доношенных детей к 14-му, у недо-
ношенных к 20—30-му дню жизни. Гипербилирубинемия у новорожденных обусловлена нарушением синтеза глюкуронил-билирубина из-за низкой активности фермента глюкуронилтрансферазы, что ведет к физиологической желтухе.
Содержание билирубина в сыворотке крови увеличивается при всех формах желтух. Определение фракции билирубина помогает в дифференциальнои диагностике желтух различного происхождения. Повышение уровня непрямого билирубина при нормальном содержании прямого наблюдается при гемолитических желтухах. Прямой билирубин нарастает при механической желтухе. В случае паренхиматозного поражения печени увеличивается содержание как прямого, так и непрямого билирубина. При циррозах печени уровень билирубина долгое время остается нормальным или незначительно повышается.
Определение билирубина в моче. Билирубин в моче определяется с помощью окислителей, под воздействием которых билирубин превращается в биливердин, имеющий изумрудно-зеленую окраску. В пробе Розина с этой целью используют 1 % раствор йода или раствор Люголя.
В пробирку наливают 3 мл мочи и осторожно по ее стенке наслаивают 0,5—1 мл 1 % спиртового раствора йода или раствора Люголя. Образование зеленого кольца на границе между жидкостями свидетельствует о наличии в моче билирубина. Зеленое кольцо может образовываться также при наличии в моче крови.
Проба Гмелина. В этой пробе в качестве окислителя используют концентрированную азотную кислоту, 1 мл мочи наслаивают на 1 мл кислоты. Проба считается положительной при образовании зеленого кольца на границе между жидкостями.
В нормальной моче билирубин указанными методами не выявляется. Пробы на билирубин положительные, если в моче появляется прямой билирубин, что наблюдается при механической желтухе, паренхиматозном гепатите и других заболеваниях. Непрямой билирубин (связанный с белком) при нормально функционирующих почках через почечный фильтр (исключая новорожденных) не проникает в мочу.
Определение уробилина в моче. Уробилин в моче можно определить с помощью ряда качественных методов.
Проба Шлезингера основана на учете зеленой флюоресценции после добавления к 2—3 мл мочи равного объема 10 % спиртового раствора уксуснокислого цинка в 96 % спирте. Образующиеся при этом флюоресцирующие цинкуробилиновые комплексы обнаруживаются после фильтрации раствора при рассмотрении на темном фоне или в ультрафиолетовом свете.
Проба Флоранса отличается большой чувствительностью Для постановки ее получают эфирный экстракт исследуемой мочи, на который наслаивают концентрированную соляную кислоту. О присутствии уробилина в моче свидетельствует образование красного кольца на границе между двумя жидкостями.
Спектроскопический метод состоит в том, что учитывается полоса поглощения уробилина, образующаяся между синей и зеленой частями спектра
Уробилин в моче появляется в преджелтушном периоде инфекционного гепатита и особенно увеличивается в первые дни желтушного периода. В разгар поражения паренхимы печени уробилин в моче почти исчезает и вновь появляется в процессе выздоровления. Продолжительная уробилиногенурия относится к неблагоприятным прогностическим признакам. Наличие уробилина в моче — постоянный симптом цирроза печени.
Определение билирубина в желчи. Билирубин в желчи определяется методом Ендрашика. Исследование в желчи билирубина, как и других ее компонентов (уробилина, желчных кислот, белка, холестерина, липидного комплекса), позволяет судить прежде всего о концентрационной функции желчного пузыря и коллоидальной устойчивости желчи. Билирубин определяется во всех трех порциях — А, В и С. Нормальное содержание билирубина в порциях А и С 0,51 -г-1,03 ммоль/л (0,3-г-0,6 г/л), в порции В — 1,71 4-3,42 ммоль/л (1 -2 г/л). Пониженное содержание билирубина наблюдается при механической желтухе, гепатитах, циррозе печени- повышенное — при гемолитической желтухе.
Уробилин в желчи определяется теми же методами, что и в моче. Повышенное содержание уробилина в желчи отмечается при циррозе печени, механической жел~ тухе, заболеваниях, связанных с гемолизом эритроцитов. У здоровых детей уробилин в желчи не обнаруживается.
Определение холестерина в желчи. Количественное определение холестерина в желчи производится с помощью реакции Либерманна—Бурхардта. У здоровых детей холестерин в порциях А и С составляет 1,04-2,08 ммоль/л (0,4-=-0,8 г/л), в порции В — 5,210,4 ммоль/л (2-г-=-4 г/л). В случае желчнокаменной болезни, гемолитической желтухи и калькулезного холецистита содержание холестерина в желчи повышено, а при нарушении оттока желчи в двенадцатиперстной кишке снижается.
ОЦЕНКА ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ ПО ИЗМЕНЕНИЯМ В БЕЛКОВОМ ОБМЕНЕ
В паренхиматозных клетках печени синтезируются альбумины, протромбин, фибриноген, а также а- и, очевидно, бетта-глобулины. В клетках ретикулоэндотелиальной системы печени и других органов синтезируются у-глобулины. Таким образом, определение плазменных белков крови может дать важные сведения, характеризующие белковообразовательную функцию печени и особенности патологического процесса (воспаления, некроза, новообразования и др.).
Методика исследования белков сыворотки крови изложена при рассмотрении методов исследования обмена веществ. При заболеваниях печени обычно отмечаются изменения в абсолютных и относительных количествах сывороточных белков, альбумина и глобулиновых фракций. При хроническом гепатите, циррозе и других длительных диффузных поражениях печени изменяется отношение альбуминов к глобулинам. Альбумин-глобулиновый коэффициент (А/Г) при этом становится ниже 1,5. В связи с заболеваниями печени (тяжелые формы гепатита, механическая желтуха и др.) часто уменьшается количество сывороточных альбуминов вследствие нарушения их синтеза. При циррозах печени, как правило, увеличивается содержание у-глобулинов. При вирусном гепатите содержание а-1- и б-глобулинов сыворотки крови снижается. В фазе выздоровления прежде всего нормализуется уровень альбуминов, позже 7-глобулинов. Стойкое повышение содержания глобулиновых фракций может указать на переход заболевания в хроническую форму.
Ориентировочные данные об изменениях в белковом составе сыворотки крови можно получить с помощью проб коллоидоустойчивости, или осадочных. Механизм осадочных проб сложен и недостаточно изучен. Результаты их зависят не только от изменений в белковых фракциях, но и в липидах, электролитах и других веществах.
Выпадение коллоидных частиц белка в осадок во многом зависит от воздействий, приводящих к увеличению их размера, уменьшению заряда и сольватационной воды, что нарушает устойчивость коллоидного раствора. Глобулины выпадают в осадок быстрее, чем альбумины. Увеличение количества грубодисперсных, гидрофобных белковых частиц (какими являются глобулины) вследствие воспалительного процесса способствует нарушению коллоидной устойчивости. Результаты осадочных проб, как и обнаруживаемая диспротеинемия, не являются специфичными только для заболеваний печени. Однако, поскольку они часто совпадают с изменениями спектра белковых фракций сыворотки крови при заболеваниях печени, осадочные пробы широко применяются в практике.
Проба Вельтмана. Базируется на нарушении коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при кипячении с раствором кальция хлорида
Готовят ряд из 11 пробирок, в каждую из которых вводят по 5 мл раствора кальция хлорида различной концентрации: 0,1 %, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03,
- 02, 0,01 %. Затем в каждую пробирку добавляют по
- 1 мл сыворотки крови и перемешивают. Содержимое всех пробирок кипятят 15 минут и учитывают пробирки, в которых произошла коагуляция.
У здоровых детей первого года жизни коагуляция происходит в первых 8 пробирках, у детей 4—6 лет — в 7—8-й, в более старшем возрасте — в 6—7-й. При инфекционном гепатите, циррозе, острой желтой атрофии печени коагуляция наблюдается в большинстве пробирок (сдвиг коагуляционной ленты вправо).
Сулемовая проба. Позволяет определить выраженность коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при титровании 0,1 % раствором сулемы. В норме помутнение происходит, если израсходовано 1,8—2 мл раствора сулемы для титрования 0,5 мл сыворотки. При поражении паренхимы печени количество раствора сулемы, ведущее к коагуляции белков сыворотки крови во время титрования, уменьшается.
Тимоловая проба. Основана на возможности помутнения насыщенного раствора тимола в вероналовом буфере при добавлении сыворотки крови.
Для ее постановки 1 мл спиртового раствора тимола смешивают с 100 мл вероналового буфера (2,06 г мединала и 2,75 г веронала, растворенные в 1000 мл дистиллированной воды). К 6 мл полученного таким образом раствора тимола добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки и перемешивают. Результат оценивают через 30— 60 минут электрофотометрически путем определения степени мутности сыворотки, сравнивая со стандартными растворами. Результат выражается в единицах светопоглощаемости или в количествах миллилитров NaOH, понадобившихся для титрования раствора до исчезновения мутности.
Проба положительна при поражении печени, в том числе при остром гепатите и его безжелтушной форме, отрицательна — при застойной и гемолитической желтухах. Тимоловая проба часто используется для оценки функции печени после перенесенного гепатита.
ФЕРМЕНТЫ
Для оценки функции печени важное значение имеет определение активности ряда ферментов сыворотки крови и печеночной ткани. Тканевые ферменты вырабатываются в различных органах и тканях, в том числе в печени. Уровень тканевых печеночных ферментов в сыворотке крови повышается при ее повреждении. Определение изоферментов, т. е. фракций одного и того же фермента, в строении которых белковые части различны, позволяет судить, за счет изменений в каких органах происходят ферментативные сдвиги в сыворотке крови.
При изучении функции печени в клинической практике чаще исследуют такие индикаторные ферменты, как трансаминазы (аминотрансферазы): глютаминоаспарагиновая трансаминаза (ACT), глютаминоаланиновая трансаминаза (АЛТ)- гликолитический фермент альдолаза- секреционные ферменты холинэстераза и церулоплазмин- экскреторные (холестатические) ферменты — щелочная фосфатаза, лейцинаминотрансфераза (ЛАТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и ее фракции (изоферменты). В табл. 38 представлены нормальные показатели активности перечисленных ферментов в сыворотке крови здоровых детей. Активность трансаминаз увеличивается при остром гепатите (желтушной и безжелтушной формах), обострении хронического гепатита и при переходе гепатита в цирроз.
Табл. 38. Активность некоторых ферментов в сыворотке крови здоровых детей (по данным различных авторов)
Примечание. М — средняя арифметическая величина- m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической.
Для ранней диагностики инфекционного гепатита ценным показателем является повышение активности альдолазы в преджелтушном периоде болезни и в начальном периоде безжелтушной формы ее.
При остром гепатите и обострениях хронического гепатита повышается активность фермента гликолитической группы ЛДГ. При агрессивном гепатите с тяжелыми дистрофическими изменениями содержание 5-й фракции ЛДГ в печени снижается и значительно увеличивается (в 6—8 раз) в сыворотке крови.
Активность фермента холинэстеразы в сыворотке крови при остром гепатите, наоборот, снижена, причем это снижение находится в прямой зависимости от тяжести забо-
левания и имеет прогностическое значение Активность холинэстеразы падает также при циррозе и других заболеваниях печени, ведущих к уменьшению ее синтетической функции, как одно из проявлений синдрома гепатоцеллюлярной недостаточности.
Для заболеваний желчных путей характерно увеличение активности ферментов холестатической группы — лейцинаминопептидазы, щелочной фосфатазы и др.
