Лабораторная диагностика вирусных инфекций - инфекционные заболевания у детей

При подозрении на вирусную этиологию заболевания необходимо предпринимать самые срочные меры по подтверждению диагноза, поскольку всякое промедление сведет на нет попытки выделить возбудитель и затруднит трактовку серологических данных.

Микроскопические исследования. Электронная микроскопия и метод флюоресцирующих антител обусловливают идентификацию вирусов. Электронная микроскопия содержимого пузырьков на коже позволяет быстро и точно отдифференцировать натуральную оспу от ветряной. Мазки слизи из верхних дыхательных путей или осадка мочи могут быть окрашены флюоресцирующими антителами для идентификации антигенов любого вируса, к которому удается получить качественную сыворотку (например, к вирусам гриппа, респираторно-синцитиальным вирусам). Вирус гепатита А и ротавирусы, возбудители гастроэнтерита у детей могут быть обнаружены с помощью методов электронной иммуномикроскопии. Еще точнее их можно идентифицировать с помощью иммуноферментного анализа сыворотки или радиоиммунологического исследования с использованием специфических антисывороток.
Цитологические исследования необходимы при выявлении внутриклеточных включений или синцитиальных изменений в клетках осадка мочи у больного с цитомегаловирусной инфекцией либо в отделяемом из носа при кори. Однако в этих случаях указанные находки необходимо срочно подтвердить выделением соответствующего вируса.
Выделение вирусов. Риккетсии и вирусы размножаются только в живых клетках. Источниками таких клеток могут быть лабораторные животные, эмбрионы куриных яиц или тканевые культуры клеток человека или животного. Выделение многих вирусов затруднено, поскольку для этого требуются разные культуры клеток, в связи с чем клиницист, направляя материал на вирусологическое исследование, должен определенным образом информировать лабораторию. Направление, в котором указано лишь одно требование: «Выделить вирус», — нерационально. Сотрудники вирусологической лаборатории могут эффективно работать и помогать клиницисту только в том случае, если последний знает, о каком вирусе или по меньшей мере заболевании идет речь.
Срочная доставка материала в лабораторию является непременным условием успеха исследования. Вероятность обнаружения вируса увеличивается, если посев производят непосредственно у постели больного. Обычно материалом для обследования на вирусы являются мазки из зева или прямой кишки или кал. Материал из зева предпочтительнее получать с помощью тампона, прилагая к нему определенное усилие, чтобы вместе со слизью удалось снять поверхностные клетки. Прп некоторых инфекциях, например при краснухе, материал для исследования следует получать с помощью носовых тампонов. Материал с тампона переносят в жидкую питательную среду (питательный бульон или 0,5% желатин в растворе Хепкса), в которой содержатся антибиотики, подавляющие рост бактериальной флоры. Тампон прополаскивают в питательной среде и отжимают между стеклами. При необходимости материал, предназначенный для исследования, можно хранить при температуре 4°С в течение нескольких часов. Транспортировать его можно, запаковав в сухой лед.
На тампоне не должно быть большого количества кала, так как в этих случаях присутствующие в питательной среде антибиотики не смогут подавить рост столь большого числа бактерий. Мазки из содержимого прямой кишки необходимо исследовать даже при инфекциях верхних дыхательных путей и ЦНС, так как многие вирусы размножаются в кишечнике.
Вирусы часто присутствуют в СМЖ, особенно в остром периоде инфекционного процесса в ЦНС. Для вирусологического исследования при первой диагностической люмбальной пункции берут небольшой объем СМЖ. Это не повредит больному, даже если в последующем будет поставлен диагноз бактериального, а не вирусного менингита.
Посев наиболее ценен при цитомегаловирусной инфекции, а также инфекционном паротите и аденовирусных заболеваниях. Мочу перед исследованием не следует замораживать и необходимо как можно скорое доставлять в лабораторию в охлажденном состоянии.
Вирусологическое исследование содержимого пузырьков на коже производят по разному в зависимости от предполагаемого заболевания: натуральная или ветряная оспа, состояние после вакцинации, герпес или энтеровирусная инфекция.
Исследование крови для выделения вирусов обычно не производят, хотя виремия нередка при многих инфекциях. Диагноз вирусного гепатита В основан на обнаружении в крови вирусного антигена, концентрация которого в сыворотке обычно бывает весьма высокой.
Основными трудностями при выделении вирусов являются нестойкость некоторых из них (например, респираторный синцитиальный вирус), необходимость работать с клеточными культурами или животными для выращивания некоторых возбудителей, длительное время, требуемое для роста некоторых вирусов, сомнения в патогенетической роли вируса, выделенного из дыхательных путей или из желудочно-кишечного тракта.
Серологические пробы. Результаты серологических исследований бывают положительными даже в том случае, если не удается выделить сам вирус. Для точной диагностики необходимо исследовать кровь по меньшей мере дважды: в остром периоде заболевания и спустя 14—21 день. Если вторую пробу крови исследовали в период до 14 дней после начала заболевания, желательно взять ее третий раз (через 4—6 нед. от начала заболевания), поскольку повышение титра антител может быть замедленно, особенно у детей. Необходимо предотвращать загрязнение проб крови и ее гемолиз. При невозможности немедленно отправить кровь в лабораторию можно получить и заморозить сыворотку. Замораживать цельную кровь недопустимо. Подтверждением диагноза служит 4-кратное повышение титра специфических антител в период выздоровления по сравнению с первой порцией крови, взятой в остром периоде заболевания. Обычно используют целый набор антигенов, в том числе вирусных.
Высокий титр антител в поздние стадии заболевания еще не позволяет отличить недавно перенесенную инфекцию от имевшей место в прошлом. Тем не менее даже при однократном исследовании сыворотки можно подтвердить диагноз, если: 1) титр специфических антител выше, чем в среднем в данной популяции- 2) определяется фракция IgM-аптител, особенно у новорожденных и больных в острой стадии гепатита А- 3) антитела, циркулирующие в крови младенца, отсутствуют у матери- 4) антитела в крови ребенка сохраняются на том же высоком уровне, что и в период новорожденности- 5) при подозрении на свинку присутствуют антитела к растворимой фракции (S) вируса в остром периоде заболевания [они могут появляться на 2-й или 3-й день болезни, когда антитела к вирусному антигену (V) могут отсутствовать или находиться в очень малом количестве]- 6) при инфекционном мононуклеозе обнаруживаются антитела в клетках, зараженных ЕВ-вирусом в условиях специальной обработки.
Методы определения антител. Антитела к вирусам могут быть обнаружены при проведении разных серологических методов, по не все из них одинаково специфичны. Комплемент фиксирующие антитела образуются при заражении многими вирусами, их появление указывает на протекающую или недавно закончившуюся инфекцию. При полиомиелите, например, эти антитела появляются в остром периоде заболевания и часто исчезают в течение 1 года. В противоположность этому нейтрализующие антитела сохраняются обычно на всю жизнь, повышение их уровня в процессе заболевания трудно проследить. Кроме того, к одному из недостатков теста с нейтрализующими антителами относится необходимость его выполнения на культуре клеток или in vivo. Уровень антител, ингибирующих гемагглютинацию, четко коррелирует с уровнем нейтрализующих антител. Многие вирусы, например миксо- и энтеровирусы, возбудители краснухи, способны агглютинировать эритроциты. Присутствие антител определяется способностью соответствующей сыворотки тормозить реакцию гемагглютинации. Многие вирусы, агглютинирующие эритроциты, способствуют адсорбции последних на поверхности зараженных клеток. Проба угнетения адсорбции используется и для выявления антител к вирусу парагриппа. Флюоресцирующие антитела к вирусам могут быть обнаружены с помощью непрямой иммунофлюоресценции.

Таблица 9-2. Микробиологические методы исследования при дифференциальной диагностике четырех основных синдромов 1

Продолжение

1 Пробы необязательно проводить во всех случаях, но обязательно при неясном диагнозе. Во всех случаях при проведении серологических реакций следует проводить двойное контрольное исследование сыворотки.

Для проведения реакции пользуются стеклами с нанесенными на них клетками, зараженными специфическим вирусом, к которому образуются антитела. Метод непрямой гемагглютинации в настоящее время получил широкое распространение в вирусологии. Это объясняется способностью вирусных антигенов фиксироваться на поверхности эритроцитов барана, обработанных глутаральдегидом или танпиновой кислотой. Все более широкое применение получают радиоиммунный и иммуноформентный методы исследования.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Уточнение диагноза инфекционных заболеваний требует строго систематизированного подхода и предусматривает рациональное применение многих культуральных и серологических методов исследования. Стратегия и тактика проведения диагностических мероприятий, естественно, определяются тяжестью состояния больного, эпидемиологическими и клиническими данными. В табл. 9—2 приведены примеры наиболее полного использования микробиологических методов исследования. К ним относятся те, которые могут быть использованы при обследовании больных с высыпаниями на коже, при подозрении на менингит, инфильтративных изменениях в легких неизвестной этиологии, подозрении на инфекционную патологию у новорожденного.

НЕКОТОРЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ИНФЕКЦИОННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

В задачи настоящего раздела входят описание и обоснование рационального подхода к обследованию детей с определенными комплексами клинических симптомов, которые чаще всего обусловлены инфекцией. Другие синдромы, признаки и симптомы (например, рвота, пневмония, инфекции верхних дыхательных и мочевых путей, отставание в развитии) обсуждаются в соответствующих разделах.