Микробиологическая лаборатория в клинике - инфекционные заболевания у детей

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ 0
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ В КЛИНИКЕ
Ответственность за правильное и эффективное использование возможностей микробиологической лаборатории с целью диагностики инфекционных болезней должны нести клиницисты. Именно они, а не сотрудники лабораторий решают, какие материалы необходимо собрать для исследования, когда и как их получить и какие лабораторные методы использовать. Клиницист должен также следить за своевременной и правильной транспортировкой полученных материалов, уметь правильно понимать и трактовать результаты микробиологического исследования.
Результаты диагностических исследований, их успех или неудача определяются выбранным материалом. Во многих случаях клиницист, руководствуясь симптоматикой заболевания, может правильно предположить его этиологию. Однако часто клиническая симптоматика настолько нехарактерна, что только микробиологическая лаборатория может помочь в диагностике. Материал для бактериологического исследования необходимо получать из органов, вовлеченных в патологический процесс, например спинномозговую жидкость следует отбирать при менингите, а внутрисуставную — при артрите. Особое внимание необходимо уделять возможным воротам инфекции, например верхним дыхательным путям у больных с менингеальной симптоматикой.
Клиницист должен решить, следует ему проводить поиски возбудителя, выявить антитела к нему либо предпринять то и другое. Для выделения возбудителя заболевания часто бывает необходимо произвести несколько посевов.

1. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Наиболее предпочтительным методом диагностики бактериальных инфекций служит выявление возбудителя в мазках и посевах.
Посевы кала. Посевы с тампона (мазок из прямой кишки) или кала производят по двум причинам: с целью идентифицировать обычные бактериальные патогены, например сальмонеллы, шигеллы, и определить преобладающую флору кишечника у больных с ослабленным иммунитетом, у которых нормальная флора может приобрести патогенные свойства. Необходимо помнить, что в кале содержатся преимущественно анаэробные микроорганизмы, а обычное бактериологическое исследование позволяет выявить преимущественно аэробные. При заболевании нормальная кишечная флора в значительной степени заменяется патогенной, в связи с чем облегчается выделение последней. Однако даже в этих условиях необходимо использовать селективные среды, задерживающие рост сопутствующей микрофлоры.
В последние годы число патогенных микроорганизмов, которые могут присутствовать в кале, заметно увеличилось. К ним относятся кампилобактерии, иерсинии и клостридии (табл. 9—1). В определенных эпидемиологических условиях необходимо исследовать кал на холерный и парагемолитический вибрионы, производя для этого посевы на специальные питательные среды.

Таблица 9-1. Некоторые патогенные микроорганизмы для культивирования которых требуются специальные питательные среды

Видео: "Со Бытие": Геннадий Онищенко рассказывает о причинах появления вируса Зика в Абхазии

Исследование отделяемого из носоглотки, зева и кожи. Сухой ватный тампон из специального материала (водоросли) наиболее удобен для получения патологического материала с кожи и со слизистых оболочек. Поскольку при высыхании патогенные микроорганизмы быстро разрушаются, тампоны с биологическими пробами необходимо немедленно поместить в плотно закрытые пробирки, которые в свою очередь помещают в переносные штативы.
Интерпретация результатов исследований культур, полученных с кожи и со слизистых оболочек, затруднена, поскольку на них и в норме находится разнообразная микрофлора. Некоторые микроорганизмы расцениваются как безусловно-патогенные, например возбудители дифтерии, коклюша, гонореи- другие, например стрептококки, стафилококки, возбудители гриппа, нейсерии, в зависимости от конкретных клинических обстоятельств могут быть расценены как патогенные, непатогенные или же только как показатели бактерионосительства. В то же время некоторые микроорганизмы, например Branhamella catarrhalis, редко становятся патогенными. Не следует слишком категорично отрицать взаимосвязь микрофлоры верхних и глубоких отделов дыхательных путей при заболеваниях легких. Поскольку мокроту для посева получить трудно, приходится прибегать к аспирации ее из трахеи или пункции легкого.
Посевы крови. Результаты бактериологических исследований крови нередко бывают наиболее важными для уточнения этиологии инфекционного процесса.
Посев необходимо производить до начала введения антибиотиков, обращая внимание на соблюдение стерильности. После венепункции меняют иглу и разливают кровь по пробиркам с питательной средой комнатной температуры. Если перед началом лечения антибиотиками нельзя получить более одной пробы, то общее количество крови должно быть достаточным, т. е. у новорожденного забирают 10 мл, у взрослого человека — 60 мл и соответственно пропорционально меньшее количество у лиц промежуточного возраста. В каждую 50-миллилнтровую колбу помещают не более 5 мл крови (для разрушения присутствующего в ней пенициллина некоторые бактериологи рекомендуют добавлять пенициллиназу). В настоящее время в питательные среды вводят сульфонат полиенэтанола для предупреждения свертывания ее и инактивации лейкоцитов. В некоторых пробирках среду обогащают С02 для выращивания анаэробных микроорганизмов. При выявлении роста посев необходимо повторить, для того чтобы определить: 1) будет ли успешным лечение, если больной уже начал принимать антибиотики- 2) не является ли рост результатом загрязнения среды пепатогеипым микроорганизмом- 3) остается ли микроорганизм в крови, если больной еще не начал получать антибиотики.
Особого анализа требует вопрос, относится ли выделенный микроорганизм к истинно патогенным или же он представляет собой результат случайного загрязнения материала во время взятия пробы, поскольку обычно непатогенные микроорганизмы могут вызывать заболевания у лиц с нарушением иммунитета,
Исследование спинномозговой жидкости. Полученную при люмбальной пункции или из желудочков мозга спинномозговую жидкость (СМЖ) необходимо собрать в стерильные емкости и немедленно транспортировать в лабораторию. В лаборатории СМЖ центрифугируют с целью осаждения микроорганизмов. При окраске осадка по Граму определяют бактериальную или вирусную природу менингита, однако впечатление, полученное при исследовании мазков, не должно ограничивать лечение. Ошибки возможны даже у опытных специалистов, поэтому предпочтительнее назначать препараты широкого спектра действия, особенно при угрожающем жизни заболевании, а не ждать результатов посева СМЖ. Коагуляция содержащей кровь или плазму СМЖ затрудняет выявление микроорганизмов и подсчет клеток. В этом случае часть ее следует поместить в пробирку с оксалатом. Большое число микроорганизмов позволяет проводить серологическое исследование с использованием антител к Н. influenzae или разным типам менингококков и пневмококков. К быстрым и точным диагностическим методам относятся количественный иммуноэлектрофорез и реакция латекс-агглютинации. Для определения антигенов, таких как П. influenzae типа b, N. meningitidis, S. pneumoniae, стрептококк группы В и Е. coli К1, может быть использована специфическая антисыворотка. Если этиология менингита остается неясной, следует с помощью окраски на кислотоустойчивые формы микроорганизмов и посева выявить микобактерии туберкулеза- рекомендуется также провести пробы на криптококковые антигены и посеять СМЖ с целью выявить грибы.
Посевы мочи. Для посева и подсчета колоний необходимо взять среднюю порцию мочи или получить ее с помощью катетера или надлобковой пункции. Последний метод более точен, так как позволяет получить менее загрязненную мочу.
При содержании в 1 мл средней порции мочи, полученной после соответствующей подготовки, более 105 микроорганизмов можно констатировать, а в количестве 104—105 лишь предполагать развитие инфекции. Это относится только к неосложненным мочевым инфекциям, вызванным грамотрицательными кишечными палочками. Другие критерии используют в отношении грамположительных и дрожжеподобных микроорганизмов у больных, страдающих мочеизнурением, хроническим пиелонефритом или получающих антибиотики. Несмотря на малую вероятность заболевания лиц, в моче которых определяется небольшое число бактерий, в любом случае необходимо производить повторные посевы и проводить клиническое обследование перед решением вопроса о методе лечения. Неадекватно большое число микроорганизмов часто обнаруживают в моче девочек, взятой без достаточной предварительной подготовки и в течение длительного времени остававшейся при комнатной температуре. В подобных случаях повторные исследования не подтверждают бактериурии. Посев необходимо производить с большой тщательностью, так как ложноположительные результаты могут обусловить длительное лечение больного антибиотиками.
Экссудаты и транссудаты. Содержимое абсцессов, внутриплевральный выпот, внутрисуставная жидкость, отделяемое из уретры, другие экссудаты и транссудаты могут быть посеяны непосредственно на агар. Необходимо возможно быстрее доставлять собранный материал в лабораторию. Кроме исследования мазков и посева, в экссудатах и транссудатах необходимо определять уровень сахара и состав клеток по тем же причинам, что и при анализе СМЖ.
Окраска мазков по Граму. Из всех жидкостей, направленных на бактериологическое исследование, в том числе и осадок мочи, должны быть приготовлены мазки, окрашенные по Граму. Бактериоскопия мазков обеспечивает получение быстрого ответа и, кроме того, помогает в последующей трактовке результатов посева.
Специальные методы культивирования. Большинство патогенных микроорганизмов можно культивировать на кровяном и шоколадном агаре и на среде Мак-Конки. В последние годы в связи с более широким использованием сред с низким восстановительным потенциалом все чаще стали выделять анаэробные микроорганизмы. Тиогликолатовый бульон, прекрасная среда для обычного посева, не благоприятствует росту строго анаэробной флоры. Пробы, в которых предполагаются анаэробные возбудители, должны транспортироваться в герметичном шприце или специальном тампоне, помещенном в бескислородную среду. В некоторых случаях по клиническим показаниям следует использовать специальные среды (см. табл. 9—1). Предположения клинициста о возможном возбудителе должны быть сообщены в лабораторию заранее. Если в лаборатории больницы отсутствует соответствующая среда, необходимо производить эти исследования в другой лаборатории.
Флюоресцентный метод. Метод флюоресцирующих антител значительно расширил возможности бактериоскопической диагностики. В настоящее время доступны разные специфические антисыворотки для многих патогенных микроорганизмов. В них молекулы антител прочно связаны с флюоресцентным красителем.
Мазок, содержащий предполагаемый микроорганизм, обрабатывают соответствующей сывороткой и микроскопируют в ультрафиолетовом свете. При этом вокруг патогенного микроорганизма концентрируются молекулы антител, обусловливая яркую флюоресценцию. Этот метод позволяет обнаружить минимальное число возбудителей в препарате. Описанная техника прямой флюоресценции возможна только в присутствии антител, меченных флюоресцеином. В противном случае прибегают к более сложной технике непрямой флюоресцентной бактериоскопии, заключающейся в следующем. Во первых, исследуемый мазок покрывают немеченой специфической антисывороткой, что позволяет фиксировать антитела, а их избыток (нефиксированные антитела) смываются. Во-вторых, к мазку добавляют гамма-глобулин, меченный флюоресцентным красителем и содержащий антитела к сыворотке животных, от которых была получена антисыворотка. При этом меченые антитела фиксируются на специфическом комплексе микроорганизм — антитело. Метод флюоресцирующих антител используют особенно для идентификации микобактерий туберкулеза, возбудителей коклюша, дифтерии, гонореи, стрептококков группы А, легионелл и др. Для выявления микобактерий туберкулеза прибегают к методу без использования антител- мазки при этом окрашивают аурамип-родамином, избирательно захватываемым микобактериями, и микроскопируют в ультрафиолетовом свете. Эта окраска более чувствительна, но менее специфична, чем обычная, основанная на свойстве микобактерий к кислотоустойчивости.
Кожные пробы. Основным показанием для проведения кожных проб остается подозрение на микобактериальную инфекцию.
Очищенные белковые производные микобактерий туберкулеза (PPD-S) и других микобактерий (PPD-B, PPD-Y и др.) сами по себе не сенсибилизируют макроорганизм, но способны выявить повышенную чувствительность его, что во многих случаях облегчает и ускоряет диагностику. Отрицательные результаты кожных проб при подозрении на туберкулез могут указывать на аллергию, в связи с чем необходимо произвести дополнительные пробы с набором антигенов, в состав которого входят антигены к грибам. Кожные тесты можно проводить и при грибковых инфекциях, но они имеют значение скорее для эпидемиологии, чем для диагностики отдельных случаев заболевания.
Серологические реакции. Типирование бактерий часто проводят с помощью реакции агглютинации со специфической сывороткой (иногда прикрепленной к частицам латекса). Определение титра антител в сыворотке имеет значение лишь при некоторых бактериальных инфекциях, в том числе вызванных стрептококками, сальмонеллами, бруцеллами, легионеллами и лептоспирами.
При стрептококковой инфекции антитела против экзотоксина исследуют Для того, чтобы определить, действительно ли они образовались во время последней инфекции.

Методы с использованием стекол типа стрептозима

Wampole позволяют быстро и точно обнаружить антитела к многочисленным экзотоксинам. В отношении сальмонелл (тест Видаля) антитела могут быть выявлены отдельно для каждой группы (А, В, С, D и др.) и для жгутиковых и соматических. Точность серологических тестов зависит от качества антисывороток, которые необходимо периодически контролировать. При проведении серодиагностики приходится учитывать возможность перекрестной чувствительности и присутствие антител после более ранних контактов с возбудителем. В любом случае достоверным считают лишь 4-кратное увеличение титра антител к соответствующему возбудителю и более.

Пробы на чувствительность к антибиотикам. В большинстве лабораторий исследуют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Соответствующая информация крайне необходима врачам-клиницистам для выбора средства лечения, но они не всегда знакомы с тем, как запросить максимальную информацию в лаборатории и каким образом интерпретировать ее.
К наиболее распространённым методам определения чувствительности к антибиотикам относится метод Кирби — Бауэра, при котором на пластинки засевают стандартизованное число микроорганизмов. Кусочек фильтровальной бумаги, пропитанный антибиотиком, помещают на пластинку и измеряют зону подавления роста вокруг каждого кусочка (диска). Концентрация антибиотика в бумажном диске примерно соответствует создаваемому уровню препарата в крови, а диаметр зоны подавления свидетельствует о чувствительности к нему микроорганизма. Должен быть известен стандартный размер зоны, указывающий на чувствительность или устойчивость к антибиотику.
Однако метод дисков отличается рядом недостатков. Так, исследования геометрических показателей позволили установить, что разница между зонами подавления роста в 1 мм соответствует 17%, что эквивалентно 17% активности соответствующего антибиотика. Следовательно, даже очень небольшая разница в диаметре зон перерастает в значительные различия активности препаратов. В связи с этим крайне важное значение приобретают точность измерения и скорость диффузии антибиотика.
Для более точного определения чувствительности к антибиотикам все шире применяются методы разведения растворов в пробирке или микротитрования на стеклах. Антибиотик последовательно разводят питательной средой в определенных объемах, примерно соответствующих уровню его в крови. Затем в каждую пробирку или на пластинку помещают определенное количество культуры микроорганизма (около 105 особей), варьирующее в зависимости от его особенностей и объема питательной среды. Через 24 ч пробирки или пластинки проверяют, определяя в них помутнение: прозрачность раствора в первой пробирке свидетельствует о минимальной концентрации антибиотиков, оказывающей бактериостатическое действие на возбудителя (минимальная ингибирующая концентрация — МИК). Затем материал из пробирок или с пластинок высевают на плотную агаровую среду для подсчета числа колоний. Концентрация антибиотика, уничтожающая 99,9 % микроорганизмов, считается минимальной бактерицидной (МБК).
Помимо технических погрешностей, ошибки могут быть обусловлены неправильной интерпретацией полученных результатов клиницистом. Интерпретировать их необходимо только при учете фармакокинетики антибиотика. В определенных клинических ситуациях ,например, при эндокардите или остеомиелите) необходимо использовать прежде всего бактерицидные, а не бактериостатические средства. При гематогенных инфекциях, обусловленных стафилококками, чувствительными к эритромицину и полусинтетическим пенициллинам, следует назначать лечение пенициллином. Необходимо принимать во внимание также токсичность лекарственных препаратов и отдавать предпочтение менее токсичным. В конечном итоге достигнутый уровень антибиотиков в крови и тканях является показателем клинической эффективности его. Так, полимиксин В подавляет рост бактерий на большой площади только in vitro- в клинике же наиболее высокая из переносимых доз не обеспечивает достаточно высокого уровня его в крови. В противоположность этому карбенициллин, не проявляющий активности in vitro, оказывается высокоэффективным in vivo, поскольку в крови создается высокая концентрация его и отмечается синергизм действия с другими антибиотиками, например с гентамицином.
Бактериостатическую и бактерицидную активность антибиотика в сыворотке или других биологических жидкостях организма больного можно измерить. Для этого возбудитель, выделенный от больного, помещают в сыворотку этого больного разного разведения, полученную через определенное время после введения антибиотика. Точно концентрацию антибиотика в крови можно определить с помощью химического или микробиологического метода, когда используют набор штаммов бактерий с точно известной чувствительностью к соответствующему препарату. Эти измерения необходимо проводить при лечении аминогликозидами больных с почечной патологией.
Значение указанных методов подтверждается данными, полученными при наблюдении за больными со стрептококковым эндокардитом. Прежде всего определяют чувствительность выделенного возбудителя к пенициллину G. При чувствительности к нему микроорганизмов измеряют бактериостатическую и бактерицидную активность препарата через 30 мин и 6 ч после его введения. Бактерицидное действие препарата отмечается через 30 мин при разведении крови не менее 1:8 и через 6 ч — в разведении 1:2.