Использованиее ферментативных реакций и радиоактивных изотопов - биоматериаловедение - полимеры медицинского назначения

Способы анализов с использованием ферментативных реакций и радиоактивных изотопов
На поверхности полимера, контактирующего с кровью, прежде всего адсорбируется белок плазмы, затем происходит адгезия тромбоцитов- далее выделяется аденозинфосфат, серотонин и другие активные вещества. Это интенсифицирует когезию и аггрегирование тромбоцитов, т. е. процесс коагуляции крови. Понимание механизма адгезии тромбоцитов является основополагающей проблемой всего развития полимерных материалов медицинского назначения, обладающих тромборезистентностью.
Lee и Kim с сотр. [47] осуществили цикл кинетических экспериментов по исследованию адгезии тромбоцитов к различным полимерным материалам- в основе методики лежало использование ферментативных реакций. Известно, что при контакте крови с полимером непосредственно перед стадией адгезии тромбоцитов начинается конкурирующая адсорбция составляющих белка плазмы. Для исследования природы и кинетики этого процесса экспериментаторы метили 1251 три составляющие белка: альбумин, у-глобулин и фибриноген. Методика радиоизотопной метки состояла в том, что сначала метили один из этих белков, а остальные оставляли немеченными- из смеси трех таких составляющих приготовляли образец искусственной плазмы с соотношением альмубин/у-глобулин/фибриноген = = 16/6/3. Затем вводили каждый образец такого типа в контакт с полимерным материалом и количественно определяли при помощи сцинциллятора адсорбцию белка в каждом отдельном случае. На рис. 94, 95 и 96 приведены кривые, описывающие кинетику адсорбирования альбумина, у-глобулина и фибриногена на образцах сополимера фторэтилена с пропиленом, сегментированного терсополимера эфира с уретаном и мочевиной и на ненаполненном силиконовом каучуке. Из графиков видно, что в зависимости от природы полимера скорость и равновесие адсорбции претерпевают очень сильные изменения.
Был проведен и такой экспериментальный цикл. Образцы, идентичные описанным, вводили в контакт с кровью на 3 мин каждый и определяли состав адсорбированного белка и адгезию тромбоцитов. Полученные результаты представлены в табл. 50.

Время, мин
Рис. 95. Конкурирующая адсорбция составляющих белка плазмы крови на поверхности сегментированного сополимера эфира с уретаном и мочевиной. 1 — фибриноген- 2 — альбумин- 3 — v-глобулин.

Рис. 94. Конкурирующая адсорбция составляющих белка, плазмы крови на поверхности сополимера фторэтилена с пропиленом.
1 — фибриноген- 2 — альбумин- 3 — v-глобулин.
Цифровой материал показывает, что у тех полимеров, которые легко адсорбируют фибриноген и у-глобулин,

Рис. 96. Конкурирующая адсорбция составляющих белка плазмы крови на поверхности ненаполненного силиконового каучука.
1 — фибриноген- 2 — альбумин- 3 — y-глобулин.
способность к адгезии эритроцитов выражена гораздо сильнее, чем у материала, легко адсорбирующего альбумин. Причины такого расхождения были предметом исследования Kim с сотр. Избранная ими методика основана на использовании ферментативных процессов.
Известно, что фибриноген и глобулин — это глюкопротеины, содержащие в боковых цепях углеводородные радикалы, тогда как альбумин глюкопротеином не является.

Таблица 50. Состав белка, адсорбированого на поверхности образцов полимерных материалов, и число адгезированных тромбоцитов

Выяснено также, что на поверхности пленки тромбоцитов существуют циалевокислотная и галактозная трансферазы (ферменты, транспортирующие соответственно циалевую кислоту из ее CMP-производного в графтозные концы и галактозу из ее CDP-производного в ацетилглюкозаминовые концы). Все это дало возможность выдвинуть рабочую гипотезу, согласно которой специфическая связь эритроцитов с белком плазмы обусловлена взаимодействием глюкотрансферазы поверхности эритроцитов с боковыми цепями глюкопротеина плазмы — одного из ее матриксов [48]. (В главе 3 уже говорилось об этой гипотезе.)
Из полиэтилена и из ненаполненного силиконового каучука выполняли трубки одинакового размера и вводили их в контакт с растворами альбумина (60 мг %), у-глобулина (60мг%) и фибриногена (20 мг %) кровяной сыворотки быка и с плазмой человека. В результате внутренняя поверхность трубок покрывалась различными белковыми отложениями. Каждую трубку обрабатывали нейраминидазой, отщепляя и удаляя тем самым от 80 до 90% циалевокислотных остатков, содержащихся в глюкопротеине. Кроме того, часть трубок подвергали еще и обработке р-галактозидазой, удаляя от 60 до 70% галактозных остатков. Белок, который до обработки ферментами содержал на концах боковых цепей циалевокислотные остатки, превращался в матрикс циалевокислой трансферазы, подходящей для того, чтобы путем ферментативной обработки удалить из трубок, обработанных однократно, циалевокислотные остатки. По-видимому, именно в силу этого он акцептировал большое количество циалевой кислоты из ее СМР-производного.
Аналогичная картина наблюдается и у белка, содержащего до ферментативного воздействия в концевых группах боковых цепей галактозу. После обработки ферментами трубок второй группы он превращается в подходящий матрикс галактозной трансферазы и, по всей вероятности, акцептирует много галактозы из ее UDP-производного.
Исходя из этой гипотезы, осуществляли дальнейшие эксперименты. Обрабатывали гомозиназой отщепленные эритроциты, получая тем самым глюкотраноферазу, и приготовляли ее смеси с мечеными образцами СМР-14С-циалевой кислоты и ОР-14С-галактозы. Затем приводили эти смеси в контакт с полимерными трубками, обработанными однократно или дважды по методике, описанной выше (во всех случаях продолжительность контакта одинакова). После этого количественно определяли при помощи сцинтиллятора перенос меченной 14С глюкозы в белок на поверхности трубок. Результаты экспериментов, проведенных при 37 °С на трубках из полиэтилена, показаны в табл. 51.
Таблица 51. Обработка боковых глюкозиых цепей адсорбированного белка и изменение активности трансферазы, переносящей циалевую кислоту и галактозу в эритроциты (трубки из полиэтилена, 37 °С) ;

Было констатировано следующее. В случае трубок, покрытых альбумином, в котором почти нет боковых цепей, активность глюкотрансферазы по отношению к тромбоцитам остается низкой независимо от того, подвергались ли трубки ферментативной обработке. С другой стороны, у-глобулин и фибриноген, содержащие в боковых цепях углеводные остатки, характеризуются (даже перед ферментативной обработкой) высокой активностью глюкотрансферазы по отношению к тромбоцитам. Что же касается циалевокислой трансферазы в период после элиминирования циалевой кислоты концов боковых цепей, а также галактозной трансферазы после элиминирования циалевой кислоты и галактозы, то активность обоих этих ферментов возрастает на целый порядок. Результаты данных экспериментов однозначно показали, что глюкозные боковые цепи фибриногена и y-глобулина, адсорбированные на полимере, функционируют в качестве акцепторов глюкотрансферазы поверхности тромбоцитов. Именно в этом причина высокой адгезионной способности эритроцитов по отношению к указанным глюкопротеинам.
Описываемое исследование имело целью раскрыть и истолковать механизм характеристической связи между бедками кровяной плазмы и эритроцитами с точки зрения матриксной специфичности глюкотрансферазы эритроцитов по отношению к структуре сахаров боковых цепей белка плазмы. В связи с этим исключительно важно было проводить все исследования в мягких температурных условиях с таким расчетом, чтобы осуществлять структурный обмен боковых цепей белков, ни в коем случае не изменяя строение основных цепей. Использование ферментативных реакций позволило Lee и Kim успешно  выполнить эту задачу. Нерешенным пока остается вопрос о причинах того, почему фибриноген и глобулин, находящиеся в адсорбированном состоянии, активно взаимодействуют с тромбоцитами, тогда как те же белки, но свободно существующие в плазме крови, отнюдь не проявляют особой активности.
Таблица 52. Влияние 1~ на адсорбцию 1311-АКС на поверхности платины, хрома и кремния (мг/м2)

Кроме того, эксперименты показали, что для количественного определения адсорбции белка на поверхности медицинских полимеров весьма эффективным оказывается способ применения радиоактивных изотопов. В литературе описаны некоторые вопросы в этой области, остающиеся пока нерешенными и требующими разработки [49]. Для метки белков наиболее часто используются изотопы 1311 и 1251. В табл. 52 показаны результаты анализов по определению адсорбции альбумина кровяной сыворотки человека (АКС) на поверхности платины, хрома и кремния. Эксперименты были основаны на использовании 1311. Образцы трех металлов предварительно выдерживали в течение 18 ч в растворе йодида натрия (1 мг/мл).
Из материала табл. 52 видно, что на поверхности хрома и кремния белок во всех случаях адсорбируется в количествах одного порядка, а на платине — гораздо интенсивнее. Вполне вероятно, что такой перепад связан со способностью платины селективно адсорбировать йод, вследствие чего она весьма восприимчива к влиянию I- в растворе. Таким образом, цифры в табл. 52 соответствуют не только адсорбции АКС на поверхности платины, но и седиментации всего объема йода в системе.
Вместо метки 1311 можно использовать 3Н. Адсорбция меченных 3Н и 1311 образцов АКС на поверхности платины и хрома показана в табл. 53. Значительный перепад уровней адсорбции, достигающий 95%, позволяет констатировать наличие специфических взаимодействий белка с материалом. Кроме того совершенно не исключены изменения структуры белка и вследствие введения меченых атомов. Так, наблюдается значительный перепад в уровнях адсорбции образцов 1311-АКС и 1251-АКСг несмотря на идентичность методов приготовления меченых образцов и условий эксперимента. Все факторы,  вызывающие расхождение, еще не истолкованы, однако возможность структурных изменений белка при введении радиоактивных изотопов не вызывает сомнений.