Гистологическая и гистохимическая микроскопия - полимеры медицинского назначения

Речь идет о методике морфологических исследований взаимодействия белка, эритроцитов и других биологических субстанций с инородными материалами с применением оптической микроскопии, а также сканирующих и пропускающих электронных микроскопов. По существу своему эта методика не отличается от сложившейся практики микроскопических исследований в патологии, гистологии, цитологии и в других областях медицины. Говоря конкретнее, к материалу, введенному in vitro или in vivo в контакт с той или иной частью живого организма, применяют серию таких, например, операций: фиксация— имплантация—срезание тонких слоев—окрашивание. Или же другую серию: фиксация—осушка замораживанием (сушка в критической точке)—окрашивание. После серии образец подвергают электронной микроскопии. Обработка образцов, предшествующая окрашиванию, должна отвечать трем основным требованиям: не вызывать изменений структуры материала- сохранять все свойства биологической субстанции (белка, эритроцитов, клеток)- не менять локализацию обеих субстанций. Очевидно, что манипуляции по окрашиванию тоже должны соответствовать некоторым специфическим     требованиям [43].
Особенности, встречающиеся при реализации способов гистологической микроскопии, целесообразно проиллюстрировать несколькими примерами.
Разрабатывая мембраны для гемодиализа в искусственной почке, Rubin и сотр. ([44] осуществили сравнительный анализ взаимодействия белка плазмы крови с составляющими эритроцитов в мембранах из коллагена и из купрофана, применяя для этой цели оптическую, а также сканирующую электронную микроскопию. Через диализатор с мембраной в виде цилиндра из коллагена или из купрофана в течение 5, 30 и 300 мин пропускали при 37 °С кровь собаки (в кровь предварительно был добавлен гепарин).
Таблица 49. Адгезия клеток крови к гемодиализным мембранам

* 0,01 кв. дюйма = 6,542 мм2. — Примеч. пер.

По истечении каждого из этих временных  интервалов мембрану промывали физиологическим раствором и отбирали на пробу ее срез определенной площади. Образец охлаждали до 4 °С и фиксировали (pH 2,2) буферным раствором 6% глутарового альдегида с 0,1 М какодилатом натрия, после чего дегидрировали, используя такой же буфер. Каждый срез сушили в критической точке и напыляли углерод и металлический палладий, после чего исследовали поверхность пленки на сканирующем электронном микроскопе. Часть образцов после обезвоживания подвергали окрашиванию на свету и исследовали в оптическом микроскопе. Некоторые результаты наблюдений приведены в табл. 49.
Цифровые данные позволяют констатировать, что на мембранах из купрофана адгезия эритроцитов протекает совершенно равномерно и весьма энергично. В то же время на коллагеновых мембранах адгезия эритроцитов очень невелика, и даже увеличение продолжительности гемодиализа вызывает лишь незначительный рост этого показателя. Таким образом, можно предполагать, что участки адсорбции эритроцитов на коллагеновой мембране полностью блокируются в самом начале диалитического процесса. Что же касается адсорбции белка, то на мембранах из коллагена она занимает 25%, а из     купрофан —10% всей площади. Электрофорез показал, что коллагеновые мембраны склонны к предпочтительной адсорбции альбумина- седиментации же фибрина вообще не наблюдалось. Все это позволяет утверждать, что уровень адгезии тромбоцитов к коллагену весьма невысок.

Рис. 91. Модель пленки живого организма (Singer, Nicolson, 1972).

1— домены, не несущие электрозаряда- 2 — электрозаряженные домены.
Используя просвечивающую электронную микроскопию, Gorman и сотр. [45] исследовали адсорбцию фибриногена к поверхности чистой слюды, а также слюды с напыленным  углеродом. Методика экспериментов сводилась к следующим операциям. Сначала осуществляли контакт аммоний-ацетатного или натрий-фосфатного буферного раствора фибриногена быка с исследуемым полимерным материалом в течение определенного отрезка времени, после чего прополаскивали, сушили, подвергали платиновому оттенению и армировали углеродной пленкой.
Далее в виде бинарной мембраны или в форме реплики исследовали методом электронной микроскопии и определяли молекулярное число фибриногена, равномерно адсорбированного на определенной площади образца. Все эксперименты этой серии проводили по единой методике при минимальной концентрации (0,06 7млн. части) фибриногена и при кратковременном его соприкосновении с образцами. Если же принять во внимание бесчисленное множество вариаций контакта крови с полимерами во всей их неизмеримой сложности при широком многообразии полимерных материалов, то можно предсказать, что применение описанного способа универсальной методики исследований встретится с очень большими трудностями.
Для современных воззрений характерно все более широкое распространяющееся мнение о том, что микрогетерогенная структура поверхности (характерный пример — структура микрорасслоения) имеет самую тесную связь с гемо- и гистосовместимостью медицинских полимеров [18]. Известно, что структура поверхности всех пленок живого организма является микрогетерогенной, как показано на рис. 91. Следовательно, и эта аналогия тоже вполне убедительно подтверждает справедливость сказанного. Тем не менее, до сих пор взаимодействие белка крови с поверхностью полимеров медицинского назначения еще не рассматривалось в совокупности со структурой микрорасслоения. Мало того, даже использование микроспектрального анализа еще не дает возможности распознать,  дефенировать и истолковать те процессы, которые протекают в доменах с размерами на уровне микронов и их долей.
Авторы данной главы в сотрудничестве с Окано и Синовара «бросили перчатку» этой проблеме, опираясь на возможности проникающей электронной микроскопии. Образцы пленок сополимеров 2-оксиэтилметакрилата со стиролом различного микрофазного расслоения (смесь полимеров, сополимеры неупорядоченного строения, блоксополимеры) приводили в контакт на 30 с с альбумином или с у-глобулином в виде сульфатных буферных растворов (pH 8,4- 0,01 М или 0,1 М- концентрация белка составляет 1/10 или 1/100 физиологической концентрации). Далее образцы промывали, фиксировали 10% формалиновым буфером, окрашивали осмиевой кислотой и анализировали методом проникающей электронной микроскопии [46]. Часть микроснимков представлена на рис. 92 и 93.
На рис. 92, А отчетливо видно микрофазное расслоение перед контактом полимеров с белком- черные пятна — стирольные домены, белая область — домен полимера 2-оксиэтилметакрилата. На рис. 92, Б отображена поверхность пленки после контакта с раствором альбумина (белок окрашен осмиевой кислотой) - видно, что альбумин «избегает» стирольных доменов и избирательно адсорбируется доменами поли-2-оксиэтилметакрилата, В—поверхность пленки образца после контакта с раствором у-глобулина- белок окрашен осмиевой кислотой.
На рис. 93, А отображена структура микрофазового расслоения образца перед контактом с белком плазмы (окрашено осмиевой кислотой: черные участки — домены поли-2-оксиэтил-метакрилата, белые — домены полистирола). На рис. 92, Б видна микроструктура поверхности образца после соприкосновения с раствором альбумина (pH 7,4). Отчетливо просматривается очень сильная тенденция к селективной адсорбции альбумина доменами поли-2-оксиэтилметакрилата- при этом сравнительно хорошо удерживается непрерывность белых полистирольных доменов. На рис. 92, В показана микроструктура поверхности образца после контактирования с раствором y-глобулина (pH 7,4). Видно, что основная масса у-глобулина адсорбируется на полистирольных (белых) доменах, причем непрерывность последних исчезает.
Все эти микрофотографии позволяют сделать ряд общих выводов. Совершенно однозначно, что альбумин адсорбируется вокруг гидрофильных доменов поли-2-оксиэтилметакрилата, а у-глобулин— преимущественно на гидрофобных полистирольных доменах. Таким образом, белки плазмы четко дефинируют различные структуры доменов микрофазового расслоения, проявляя высокую избирательность при адсорбировании на этих доменах.

Рис. 92. Селективная адсорбция белка плазмы крови пленочными образцами смешанного сополимера 2-оксиэтилметакрилата со стиролом структуры микрофазового расслоения.
Объяснения в тексте.

Рис. 93. Электронные микрофотографии избирательной адсорбции белка плазмы крови блоксополимером 2-оксиэтилметакрилата со стиролом структуры микрофазового расслоения.
Объяснения в тексте.
Тот путь, который должен привести к пониманию природы совместимости крови с инородными материалами, — это самое детальное исследование специфических взаимодействий всей сложнейшей системы крови с поверхностью структур  микрофазного расслоения — от молекулярного до клеточного уровня. По всей вероятности, такой путь единственный. Можно ожидать, что гистологические и гистохимические методы, приемы и способы анализов окажутся действенным орудием исследований в этом направлении.