Электрофорез - биоматериаловедение - полимеры медицинского назначения
Известно, что пропускание электрического тока через систему, содержащую статически заряженные молекулы или другие частицы, вызывает направленную миграцию последних к положительному или отрицательному электроду в зависимости от знака заряда частиц. Использование этой закономерности для разделения, очистки, идентификации молекул и частиц и для других процессов называется электрофоретическим анализом [38, 39]. В области биоматериаловедения практикуются две методики электрофореза. Первая, называемая «зонным электрофорезом», состоит в том, что в качестве подложки-носителя используют фильтровальную бумагу, агар-агар, а также гели типа крахмала или полиакриламида. Вторая методика, называемая микроэлектрофорезом, или целлюлярным электрофорезом, заключается в непосредственном прослеживании миграции заряженных микрочастиц при помощи оптического микроскопа. Ниже обе эти методики рассмотрены достаточно подробно.
Гель-электрофорез
Для разделения составляющих белка, адсорбируемого на поверхности полимера при его контакте с кровью, Lyman и сотр. [40] применяли электрофорез- носителем служил гелеобразный полиакриламид. На зоологическом уровне методика экспериментов сводилась к следующим манипуляциям.
В нисходящие аорты собак вставляли и закрепляли дакроновыми муфтами переходные трубки одинакового диаметра, выполненные из исследуемых полимеров. Схема крепления и модели переходных трубок показаны на рис. 84. Кровь пропускали через переходник в течение определенного времени, затем снимали его и погружали в физиологический раствор, содержащий нейтральное поверхностно-активное вещество Triton Х-100 1% концентрации. Исследователи сообщали, что использование такого агента почти исключает денатурацию белка: практически весь белок, адсорбировавшийся на трубке после 45-часового протекания крови (при 25 °С), удалось перевести в раствор и регенерировать.
Рис. 84. Переходные трубки трех моделей из медицинских полимеров, вставляемые в нисходящую аорту.
А, Б, В — модели А, Б, В.
Полученный раствор пропускали через ультрафильтрационную кювету с диафрагмой РМ 10 (фирмы Amicon), элиминируя вещества с молекулярной массой менее 10 000, затем концентрировали и сразу же подвергали экстракт (200 мкл) электрофорезу с использованием полиакриламидного геля. Миграционный анализ вели при постоянном напряжении 300 В и температуре 20°С в течение 47 мин- в качестве буфера использовали систему 0,065 М борной кислоты (pH 9). По завершении миграции гель окрашивали и обесцвечивали и проводили сканирующую денситометрию, в результате чего удалось осуществить градуировочную идентификацию составляющих белка.
Рис. 85. Картина электрофореза белка (альбумин), адсорбированного на поверхности сополимера эфира с уретаном и мочевиной (материал PEUU 1025 М).
1— контакт 45 мин- 2 — контакт 9 мин.
Рис. 86. Картина электрофореза белка (альбумин), адсорбированного на поверхности разных полимеров медицинского назначения.
1 — полифторэтилен-пропилен, 30 мин- 2 — силиконовый каучук, 45 мин- 3 — сополимер эфира с уретаном и мочевиной, 45 мин.
На рис. 85 показана картина электрофореза белка (альбумина), адсорбированного после пропускания крови через отводную трубку из сегментированного сополимера эфира с уретаном и мочевиной (PEUU 1025)- кровь пропускали в течение 9 мин, а также 45 мин. Из кривых видно, что 45-минутного соприкосновения полимера с кровью достаточно для достижения адсорбционного равновесия. Для сравнения был осуществлен электрофорез белка (альбумина), адсорбированного по той же методике на ненаполненном силиконовом каучуке (SR) и на полифторэтилен-пропилене (FEP). Общая картина миграции представлена на рис. 86- цифровые данные приведены в табл. 46. Графический и цифровой материалы свидетельствуют о том, что природа полимера оказывает на состав адсорбируемого белка плазмы чрезвычайно большое влияние.
Таблица 46. Адсорбция белка на поверхности некоторых медицинских полимеров (in vivo)
Таблица 47. Адгезия тромбоцитов на поверхности полимерных материалов медицинского назначения
Очевидно и то, что состав белка претерпевает также временные изменения. Бросается в глаза, что из двух сополимеров эфира с уретаном и мочевиной тот, у которого молекулярная масса полиэфирного блока больше, т. е. материал PEUU 1025, отличается исключительно высокой избирательной способностью по отношению к альбумину.
Начальный этап тромбообразования состоит в том, что на поверхности полимера адгезируются и когезируются, затем агглютинируются и образуют аггрегацию тромбоциты, и чем выше селективная адсорбционная способность полимера к альбумину, тем меньше адгезия на нем тромбоцитов. Такая закономерность четко прослеживается по данным табл. 47.
Таблица 48. Адгезия тромбоцитов к поверхности полимерного материала, покрытого белком
Все эти наблюдения позволили Lyman вывести рабочую гипотезу о том, что антитромбогенность полимерного материала находится в теснейшей связи с его адсорбционной избирательностью по альбумину. Предложение это полностью подтверждается данными, приведенными в табл. 48. Цифры были получены в результате серии экспериментов, проведенных на образцах ненаполненного силиконового каучука (SR), предварительно покрытых альбумином, фибриногеном или у-глобулином. Их вводили в контакт с кровью и по истечении определенных отрезков времени измеряли объем адгезированных тромбоцитов. Методика перевода адгезированного белка в раствор с последующим электрофоретическим анализом позволяет получить ценную информацию, однако она связана с весьма трудными проблемами, разрешение которых требует дальнейших разработок.
Так, например, данная методика оказывается пока бессильной для анализа самой начальной стадии тромбообразования, которая протекает на поверхности полимера за первые несколько секунд контакта с кровью и рассматривается как исключительно важная, может быть, определяющая. Кроме того, возможности гель-электрофореза не распространяются на многие особенности конформационных изменений адсорбированного белка, распознаваемые и регистрируемые другими аналитическими методами. Наконец, весьма проблематично и то, что весь адсорбированный белок целиком и полностью переходит в раствор при обработке поверхностно-активным веществом [41]. Имеются и другие вопросы в области гель-электрофореза, требующие разрешения.
Микроэлектрофорез (целлюлярный электрофорез)
Сущность микроэлектрофореза достаточно хорошо известна и сводится к тому, что частицы вещества (включая клетки биологических субстанций), несущие электрический заряд, взвешивают в растворе электролита в кювете для электрофореза и непосредственно наблюдают миграцию этих частиц в электрическом поле постоянного тока при помощи оптического микроскопа. Принципиальная схема установки для анализов способом микроэлектрофореза показана на рис. 87.
Под действием собственной массы частицы седиментируются. Одновременно они перемещаются по направлению к противоположно заряженному электроду со скоростью, пропорциональной поверхностной концентрации зарядов. Таким образом, результирующее направление миграции может быть представлено в виде диагонали параллелограмма (рис. 88).
Скорость миграции частиц можно определять при помощи градуированного микроскопа с использованием секундомера. В результате электроэндосмоса в кювете мигрируют не только заряженные частицы, но и сам электролит. Центральное и периферические течения этой среды идут противотоком и при соударении взаимно погашаются, образуя зону покоя в виде плоскости, в которой течения отсутствуют. Общая схема движения потоков электролита в кювете показана на рис. 89.
Необходимо сфокусировать микроскоп с таким расчетом, чтобы наблюдать миграцию только тех частиц, которые находятся именно в плоскости покоя. Таким образом, при исследовании движений наимельчайших частиц, осаждающихся крайне медленно, надо устанавливать кювету горизонтально и вести наблюдение сверху вниз. Обычно же кювету фиксируют в поперечном положении, соответствующем плоскости покоя, и ведут наблюдения по горизонтали.
1-термостат- 2—микроскоп- 3 — оптическая система- 4 — гелий-неоновый лазер- 5 — миграционная кювета горизонтального типа- 6 - приспособление для фиксации кюветы в горизонтальном или вертикальном положении.
Рис. 88. Миграция частиц при микроэлектрофорезе.
Рис. 89. Потоки среды в кювете для микроэлектрофореза.
Рис. 87. Установка для микроэлектрофореза.
Chiu и Nyilas с сотр. [42] изучали методом целлюлярного электрофореза конформационные изменения фибриногена, адсорбированного микропорошками двух веществ: стекла и изотропного углерода LTI (lowtemperature isotropic Carbon), отличающегося высокой тромборезистентностью- диаметр частиц порошков измерялся в микронах. Объем фибриногена, адсорбированного частицами, изменяли в достаточно широких пределах, варьируя условия адсорбции, т. е. концентрацию белка. Миграцию начинали определять только после того, как частицы достигали плоскости покоя. Анализируя по 12—14 частиц, вычисляли среднюю степень электрофорезного перемещения, а затем строили график ее зависимости от коэффициента 0 покрытия, описываемого следующей формулой:
Коэффициент относительного поверхностного покрытия частиц белком,
Кривые такой зависимости, относящиеся к стеклу (9,85 м2/г) и к изотропному углероду LTI (27,7 м2/г), приведены на рис. 90.
Как только коэффициент поверхностного покрытия превышает 20%, подвижность частиц стекла резко снижается, подвижность же частиц углерода LTI не меняется до тех пор, пока значение коэффициента 0 не достигнет 0,6, и лишь после этого начинает постепенно уменьшаться. Эта закономерность была интерпретирована следующим образом. На стекле фибриноген адсорбируется в небольшом объеме, однако он распространяется по всем участкам отрицательно заряженной поверхности и интенсивно их блокирует. В то же время фибриноген, адсорбированный на материале LTI, почти не оказывает блокирующего действия на соответствующие зоны. Иначе говоря, все заключается в том, что при адсорбции фибриногена к стеклу конформация его макромолекул очень сильно меняется, тогда как адсорбция к углеродистому материалу почти не вызывает конформационных преобразований.
Рис. 90. Подвижность адсорбировавших фибриноген частиц (стекло, LTI Carbon) при микроэлектрофорезе.
- — частицы углерода (27,7 м2/г;
- — частицы стекла (9,85 м2/г).
Описанное исследование представляет единственную в своем роде попытку применить электрофорез для анализа электрозаряженности частиц материалов, адсорбировавших белок, и тем самым получить новые сведения о конформационных изменениях белковых макромолекул. В этом смысле оно остается пока уникальным. Трудности метода можно резюмировать следующим образом. Во-первых, необходимо учитывать, что вследствие конформационных преобразований белка меняются условия его поверхностной заряженности. Во- вторых, следует принимать в расчет значительные расхождения в диаметре, конфигурации, условиях поверхностной заряженности, уровне свободной поверхностной энергии и в других характеристиках частиц, обусловленные техническими причинами, в частности измельчением образцов. Существуют и другие трудности, связанные с применением микроэлектрофореза в биоматериаловедении.
