Иммуноферментные методы диагностики - системная красная волчанка, системная склеродермия, ревматоидный артрит
Видео: Конференция "Персонифицированные технологии в ревматологии"
ГЛАВА IV
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ
Иммуноферментный анализ является одним го наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в этом методе уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации являются несомненными достоинствами метода, обуславливающими его широкое применение в медицине.
Суть метода состоит в специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами. Классические методы иммунохимического анализа основаны на образования антителами в присутствии антигена преципитата (осадка). Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело в растворе может быть осуществлена, ecли в один их исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко определяется соответствующим высокочувствительным физикохимическим методом. С этой целью применяются изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген-антитело прочно иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов.
Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченных реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.
Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологический анализ, предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой является изотоп 1-125, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа. Разработка этого метода явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченных соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон в 1977 году были удостоены Нобелевской премии.
Наряду с преимуществами радиоиммунологический метод имеет и недостатки, к которым относятся дороговизна оборудования и экологическая небезопасность, связанная с возможностью радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, и необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала. Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных радиоиммунологическому, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессивность.
На протяжении последних десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунных комплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа.
Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений - антител, пептидов, вирусных и бактериальных антигенов, фармакологических препаратов.
Особую значимость для широкого внедрения твердофазного иммуноферментного анализа в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах радиоиммунологического анализа. Внедрение в практику иммуноферментного анализа полистирольных плат позволило упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы.
Наиболее распространенными схемами иммуноферментного анализа являются следующие: конкурентная, метод последовательного насыщения, «сандвич»-метод и метод определения антигенов с использованием меченных антивидовых антител.
Принцип конкурентного иммуноферментного анализа состоит в одновременном добавлении определяемого и меченного ферментом антигена к антителам, доведения системы до равновесия и последующего измерения ферментной метки в комплексе с антителами или в несвязанном меченом антигене.
В отличие от конкурентного иммуноферментного, метод последовательного насыщения основан на последовательном взаимодействии антител сначала с определяемым, а затем с меченным ферментом антигеном. Проведение анализа возможно двумя путями. В первом случае меченный антиген добавляется непосредственно в инкубаций иную смесь, содержащую антитела и исследуемый образец. Во втором случае (возможном только при применении твердофазного иммуноферментного анализа) иммуносорбент после первой реакции отмывают от несвязавшихся комплексов, а затем вводят меченный антиген. Этот метод позволяет избежать возможного ингибирующего влияния компонентов исследуемой биологической жидкости на ферментмаркер. Концентрация связавшегося с антителами конъюгата пропорциональна начальной концентрации антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
«Сандвич»-метод основан на использовании иммобилизованных и меченных специфических антител и является одним из наиболее распространенных подходов для анализа поливалентных антигенов. Метод существует в нескольких модификациях. Наиболее широко распространенная включает две стадии. На первой определяемый антиген взаимодействует с иммобилизованными антителами, затем иммуносорбент промывают и добавляют меченные ферментом антитела, степень связывания которых со свободными детерминантами пропорциональна начальной концентрации антигена. Вторично промывают субстрат и регистрируют количество метки, связавшейся с иммуносорбентом.
Конкурентный метод с использованием меченных антивидовых антител позволяет определять разные антигены (как моно-, так и полидетерминантные) с использованием одних и тех же меченных антител. Анализ проводят следующим образом. К иммобилизованному на носителе антигену добавляют определяемый антиген и специфические антитела. В процессе инкубации иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. В результате на носителе образуется комплекс антиген-антитело, концентрация антител в котором пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. После удаления избытка несвязавшихся компонентов к носителю добавляют меченные ферментом антивидовые антитела, образующие комплекс со специфическими антителами. После удаления избытка меченных антител регистрируют концентрацию метки на носителе. Таким образом, в методе сочетаются принципы конкурентного и «сандвич»-анализа.
Естественно, что для проведения всех этих способов иммуноферментного анализа необходимо наличие антител к определяемому субстрату. Таким образом, важным моментом является получение антисывороток и поликлональных антител. С этой целью в настоящее время применяют иммунизацию животных адьювантом Фрейнда, после чего проводят выделение и очистку антител, то есть удаление неспецифических антител. В некоторых модификациях иммуноферментного анализа используются конъюгаты ферментов не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена, Fab-фрагментом.
Поликлональные антисыворотки часто имеют высокую перекрестную реактивность, что делает затруднительным и даже невозможным их использование в иммуноанализе. Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченных количествах с идентичными от партии к партии физико-химическими характеристиками. Основным свойством, на котором основано применение моноклональных антител, является высокая специфичность взаимодействия. Использование моноклональных антител в «сандвич»- модификации позволяет сократить время анализа.
Уровень антител к коллагену I типа и фибронектин можно определять многими методами: иммуноферментного анализа, иммунофлуоресцетгным, методами ракетного иммуноэлектрофореза и агглютинации. Среди них метод твердофазного иммуноферментного анализа имеет преимущества в простоте, доступности использования, точности и достоверности. Вот почему большинство результатов изучения антител к коллагену и фибронектина, приведенных ниже, получены методом иммуноферментного анализа.
Для исследования уровня антител к коллагену Г типа, общего и иммуноактивного фибронектина осуществляется забор крови в полипропиленовые пробирки. В пробирки, предназначенные для определения фибронектина, добавляется антикоагулянт 3,8% цитрат натрия в соотношении кровь к антикоагулянту 1:9 по объему. Для предотвращения протеолитического расщепления фибронектина к раствору антикоагулянта добавляется трасилол в количестве 40 ED/мл. Кровь сразу должна быть центрифугирована в течение 15 мин при 3000 оборотов/мин. Полученные сыворотки и плазмы переносятся в пластиковые эппо дорфы, замораживаются и хранятся при tt-20°C. До выполнения анализов пробы не должны размораживаться для предотвращения образования фибронектин-С, представляющего собой расщепленную молекулу (Morrink et al., 1985). Время от забора образцов сыворотки и плазмы до выполнения анализов не должно превышать 6 месяцев.
Антитела к коллагену I типа определяются методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием нативного гетерологичного коллагена I типа (Katsuyuki F. et Michiko Т.).
Нативный коллаген I типа применяется для иммобилизации на полистироловых планшетах фирмы «Libro Plastics» (США). Коллаген вносится в лунки планшета по 200 мкл в фосфатном буфере 0,01М pH 7,4. Планшеты инкубируются в течение 15-18 ч при t±4°C, затем многократно отмываются водопроводной водой с 0,05 %-м тайном 20 и вносятся в лунки по 200 мкл исследуемых образцов сыворотки крови, разведенных 1:1000 фосфатно-солевым буфером pH 7,2. Образцы инкубируются в лунках в течение 30 мин при t±37°C. Лунки вновь отмываются, как указано выше, и в каждую из них добавляют по 200 мл конъюгата противоколлагеновых антител с пероксидазой в рабочем разведении. Конъюгат инкубируют 30 мин при t±37°C и после отмывки планшетов в каждую лунку вносят по 200 мкл субстратной смеси, состоящей из 0,0015 %-го раствора перекиси водорода и 0,01 %-м раствором ортофенилендиамина в 0,05М цитратном буфере pH 4,7. После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением в лунки 50 мкл 50%-й серной кислоты. Интенсивность окраски субстратной смеси измеряется при длине волны 492 нм.
В качестве образца сравнения берется пул сыворотки, полученной от 100 доноров. Результаты определяются по формуле:
А — То/Тк • 100, где Тк - титр образца сравнения-
То - титр исследуемого образца.
Уровень общего фибронектина плазмы определяется по методике Г. А. Ермолина с помощью ELISA в «сандвич- модификации».
Кроличьи антитела к фибронектину человека используют для иммобилизации на полистироловых планшетах («Libro Plastics»). Антитела вносятся в лунки планшета по 200 мкл в карбонатном буфере 0,01М pH 9,6 (содержание белка 10 мкг/мл). Планшеты инкубируют в течение 15-18 ч при t 4
Стандартную калибровочную кривую получают, используя фибронектин, который для калибровочной кривой разводится в фосфатно-солевом буфере с 0,05 % - м твином 20 pH 7,2-7,4. В результате анализа серии полученных калибровочных кривых, построенных в координатах, величина экстинкции - количество фибронектина, выбирается линейный участок калибровочной кривой, включающий следующие количества фибронектина: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 нм/мл. Содержание фибронектина в исследуемых образцах плазмы крови определяют по стандартной калибровочной кривой. Стандартные разведения фибронектина для построения калибровочной кривой готовятся для каждого планшета.
Физиологически молекула фибронектина плазмы способна реализовывать свою связывающую опсоническую активность только при условии наличия хотя бы одного свободного домна к коллагену (EngvaJl Е. et al, 1977). При этом одна молекула фибронектина имеет 2 домена - по одному в каждой субъединице (D&rsquo-Ardenne A. et al., 1984). Таким образом, определяя уровень общего фибронектина плазмы, нельзя с достаточной, достоверностью судить о функциональной активности его молекул, так как реакции определения основаны на распознавании видовых эпитопов.
Дня определения содержания иммуноактивного фибронектина плазмы используется модификация ELISA,, при котором на полистироловых планшетах иммобилизовывают не антитела как «сандвич-метод», а 1 % - й раствор желатина, с которым фибронектин связывается через коллагеновый домен. Таким образом, для определения в планшете с желатином на твердой фазе взаимодействуют только молекулы фибронектина плазмы, имеющие свободный домен, «липкий» к коллагену. В качестве стандарта используется свежая плазма здорового донора с известным содержанием общего фибронектина плазмы. Расчет содержания иммуноактивного фибронектина плазмы в пробах вычисляется по формуле:
К = 1 - (х - N/x), где К - количество иммуноактивного фибронектина плазмы, выраженное в условных единицах-
х - экстинция образца-
N - экстинция донорской плазмы.
