Иммуноморфологические методы - хламидийная инфекция в акушерстве и гинекологии
Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций с помощью специфических антител, соединенных с какой-либо меткой (флюоресцирующей, ферментной, радиометкой). Наиболее распространены прямой и непрямой иммунофлюоресциентные методы прямая иммунофлюоресценция и непрямая иммунофлюоресценция. Их чувствительность составляет 90-100%, специфичность при исследовании препаратов из урогенитального тракта - 85-100%. Однако применение прямая иммунофлюоресценция и непрямая иммунофлюоресценция требует правильной оценки результатов, т. к. флюоресцировать может зернистость в лейкоцитах.
Для взятия материала используются специальные щеточки или дакроновые тампоны. Для качественного окрашивания препаратов необходимо использовать специальные стекла для иммунофлюоресценции с лункой в середине стекла. Следует особо обратить внимание на то, что при нанесении материала тампон или щеточка должны прокатываться по стеклу. Препарат должен быть доставлен в лабораторию в день взятия материала. В случае необходимости фиксированные в течение 1-2 минут холодным ацетоном препараты можно хранить в бытовом холодильнике в течение 3 дней.
Последовательность операций при использовании иммунофлюоресцентных методов следующая. Препарат-мазок фиксируют охлажденным ацетоном. Затем на него наносят меченую сыворотку или моноклональные меченые антитела и помещают его во влажную камеру в термостат на 15 мин. Для контрастирования на препарат наносят бычий альбумин, меченный родамином, или синьку Эванса. Современные наборы с моноклональными антителами содержат в своем составе синьку Эванса. После 15-минутной инкубации стекла интенсивно промывают фосфатно-солевым буфером pH 7,2 или проточной водой. На высушенные мазки наносят 1 каплю забуференного глицерина (9 мл глицерина и 1 мл фосфатно-солевого буфера), накрывают покровным стеклом и прижимают фильтровальной бумагой, чтобы удалить избыток жидкости. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе "ЛЮМАМ" (светофильтры БС 8-2, СЗС 14-4, ФС 1-2, объектив х90, окуляры х10, собственное увеличение бинокулярной насадки х 1,5) или люминесцентном микроскопе других моделей с использованием объективов х20, х40, х100.
Учет результатов проводят по наличию элементарных телец в поле зрения или в препарате (более 5), флюоресцирующих ярко-зеленым (яблочно-зеленым) цветом на фоне эпителиальных клеток, окрашенных в оранжевый или красный цвет.
Результат анализа выдается обычно на следующий день. Рекомендуются следующие варианты ответа: "Методом прямая иммунофлюоресценция обнаружены Chlamydia trachomatis", "Методом прямая иммунофлюоресценция Chlamydia trachomatis не обнаружены", "Рекомендуется исследование повторить (из-за отсутствия клеток в препарате или неспецифической флюоресценции)".
Иммунопероксидазный метод диагностики имеет сходство с иммунофлюоресцентным. В качестве маркера используется фермент пероксидаза. Выявление комплекса "антиген - антитело - пероксидаза" достигается гистохимической реакцией на пероксидазу с субстратом-индикатором 3-3` диаминобензидинтетрагидрохлоридом - ДАВ. Продукт реакции окрашивается в коричневый цвет, что позволяет выявить локализацию антигена внутри клетки. Чувствительность и специфичность метода возросли после введения в практику моноклональных антител и составили соответственно 100% и 92.4%.
Иммуноферментный анализ
Данный метод основан на обнаружении растворимого антигена хламидий в исследуемой пробе. Тест представляет собой метод твердофазного иммуноферментного анализа. Клинический материал берут тампоном в специальные транспортные пробирки, которые поставляются производителями наборов, и доставляют в лабораторию в течение 48 часов на холоде. Перед транспортировкой хранят при 4-6 С. До исследования образцы нельзя замораживать.
Постановку реакции следует осуществлять строго по предложенной фирмой инструкции. После проведения всех манипуляций учитывают результат. Положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена С. trachomatis, абсорбированного на шарике или в ячейке панели. Точный результат определяют с помощью спектрофотометра "Мультискан" или другого аппарата, предназначенного для этих целей, при длине волны 492 нм. Образцы, дающие значение поглощения выше или равное значению отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными, т. е. они говорят о наличии антигена С. trachomatis в исследуемой пробе. Чувствительность и специфичность иммуно-ферментных методов диагностики составляет соответственно 65-70% и 90-100%.
Результат исследования выдается через 1-3 дня. Варианты ответа: "Методом ИФА обнаружены С. trachomatis", "Методом ИФА С. trachomatis не обнаружены".
