Кр-микроскопия биологических структур - лазерная диагностика в биологии и медицине
КР-микроскопия биологических структур и живых клеток
Методы микроскопии КР дают большие возможности для исследований in situ на клеточном уровне. Объединение спектрометра КР с обычным оптическим микроскопом в один прибор позволяет использовать все способы наблюдения клетки, разработанные в оптической микроскопии, без какой-либо специальной подготовки объекта. Можно выделить две основных методики измерений: точечное освещение объекта с одноканальной регистрацией и общее его освещение с многоканальной регистрацией.
В первой методике пучок лазерного излучения фокусируется оптической системой микроскопа в пятно, размеры которого определяются дифракционным пределом (менее 1 мкм в перетяжке). Рассеянный назад исследуемым образцом свет собирается тем же объективом и направляется на входную щель спектрометра.
Во второй методике частично расфокусированным пучком освещается большая область (150—300 мкм в диаметре). Из всего КР-спектра выделяется одна составляющая, соответствующая какому-либо волновому числу и отражающая наличие некоторого специфического компонента образца. Далее строится микрографическое изображение, отображающее распределение этого компонента по освещенной области. Получение такого КР-изображения/постигается путем передачи через спектрометр оптического изображения, формируемого объективом микроскопа, на фотокатод многоканального детектора.
Можно также получать изображение объекта сканированием по нему сфокусированным пучком.
Были получены КР-изображения малых объемов нативной древесной ткани [29]. При этом экспериментальные спектры соответствовали двум основным компонентам этой ткани: целлюлозе (линии 330, 380, 1098, 2890 и 2940 см-1) и лигнину (линии 1120, 1150, 1340, 1380 и 1450 см-1).
Микроскопия КР используется также и в резонансном варианте. Например, были получены КР-изображения хромобактерий [30] и различных видов морских водорослей [31] как в суспензии, так и одиночных клеток. Так, РКР- спектры в диапазоне 900—1600 см-1 были получены для
типов содержащих каротин бактерий и 9 клонов морского планктона. Было показано, что имеются четкие различия в спектрах клеток разных типов. При этом индивидуальные клетки могут быть детектированы на фоне суспензии других клеток без необходимости их предварительного разделения [32].
По сравнению с КР-микроскопами, использующими спонтанное КР света, АСКР-микроскопы дают существенно более сильный сигнал [33]. Их пространственное разрешение определяется главным образом параметрами системы получения изображения, а не диаметром сфокусированного пучка. Так как монохроматор не нужен, то пространственное разрешение не ограничивается параметрами дифракционных решеток.
В [33] описан АСКР-микроскоп с пространственным разрешением 0,7 мкм, которое потенциально может быть доведено до 0,35 мкм. Изображение клеток кожицы лука в диапазоне 1900—2700 см-1 получали сканированием в пределах 300 х 300 мкм. Выбор этого диапазона волновых чисел определяется тем, что он сравнительно свободен от линий, соответствующих большинству колебаний молекул, но включает линии дейтерированных связей С—Н и О—Н.
Клетки предварительно выдерживали в D20 в течение 4 часов. Общее изображение клетки при настройке на линию 2450 см-1, соответствующую колебанию О—D, в целом повторяло ее обычное изображение в белом свете, однако не содержало ядер как составных частей. Это говорит о том»
что за 4 часа D20 проникает во все области внутри клетки, кроме ядёр.
Этот эксперимент показывает возможности АСКР-микроскопии для изучения динамики обмена веществ на клеточном уровне.
