Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток - лазерная диагностика в биологии и медицине
Лазерная доплеровская спектроскопия живых клеток и диагностика внутриклеточной подвижности
Общие сведения. К настоящему времени выполнено большое число исследований по разработке методов и практической регистрации подвижности живых клеток в суспензиях: бактерий, сперматозоидов животных и человека, водорослей и др. (см., например, [50—54]). Эта подвижность имеет характер не тепловой диффузии, а случайных блужданий с элементами прямолинейного, вращательного и спирального движений. Каждое из этих видов движений вносит свою лепту в доплеровское уширение спектров. Поэтому точное описание светорассеяния выливается в сложные многопараметрические математические модели. Тем не менее разработанные процедуры позволяют получать из экспериментально измеренных спектров распределения скоростей, относительное число подвижных и неподвижных клеток и ряд других параметров.
Учитывая, что по этому вопросу опубликовано большое число обзорных работ (см., например, [53, 54]), мы не будем останавливаться на нем подробно, а перейдем к обсуждению исследований внутриклеточной подвижности, в которых применение лазерной доплеровской спектроскопии (ЛДС) является весьма многообещающим [55, 56].
Первое использование этого метода для решения задач регистрации направленной внутриклеточной подвижности в крупных растительных клетках относится к 1974 г. [57]. Были получены четкие доплеровские спектры, характеризующие распределение скоростей стационарного движения светорассеивающих частиц, составляющих протоплазму этих клеток (ядер, митохондрий и др.). В последующей серии работ [58—64] была продемонстрирована высокая эффективность ЛДС как регулярного метода решения задач биофизики подвижности, позволяющего осуществлять регистрацию нестационарных откликов клетки на внешнее воздействие, что важно при изучении механизмов пространственно-временной организации клеточной подвижности, ее регуляции и пр.
Особенностью лазерного зондирования одиночных неподвижных живых клеток является то, что свет рассеивается не только движущимися внутриклеточными органоидами, но также и неподвижными клеточными стенками. В первом случае в рассеянном свете появляются доплеровские сдвиги частоты, в то время как во втором частота рассеянного света не изменяется.
Этот второй компонент рассеянного света неизбежно попадает на фотоприемник, что позволяет использовать этот компонент в качестве опорного излучения для переноса доплеровских сдвигов частоты в низкочастотную область путем гетеродинирования. Таким образом, однолучевой схемой зондирования можно в принципе обеспечить гетеродинный режим измерения скоростей движения внутриклеточных частиц. При этом, конечно, должны выполняться условия эффективного ОС и гетеродинирования, что в некоторых случаях происходит автоматически, а в некоторых требует дополнительных усилий.
Рис. 3.11, Блок-схема измерительно-вычислительного комплекса на базе однолучевого ЛДС
Описание установки. На рис. 3.11 изображена схема измерительно-вычислительного комплекса, созданного для изучения внутриклеточной подвижности [65]. Излучение Не—Ne лазера типа ЛГ-38 (/), ослабленное набором фильтров (2), фокусируется линзой (5) на клетку (4), закрепленную в кювете (5) в специальных держателях (6). Рассеянный свет поступает через систему линз и диафрагм (7) на ФЭУ (8), работающий в токовом режиме. Сигнал после усиления и фильтрации в НЧ усилителе (9) поступает параллельно на осциллограф (10) для визуального контроля, на анализатор спектра реального времени типа СК4-72 (11), имеющий кроме электронно-лучевого индикатора цифровой выход, и на аналого-цифровой преобразователь (АЦП) (12), преобразующий аналоговый сигнал в дискретные выборки с программно устанавливаемой частотой дискретизации и длительностью. Эти выборки поступают на ЭВМ (13) для спектральной обработки, которая выполняется по ходу или после записи выборки в память.
Все приведенные ниже результаты получены путем обработки сигнала на ЭВМ ЕС-1010, хотя вместо нее могла быть использована любая другая машина того же класса. На эту же машину могут подаваться оцифрованные спектры с выхода анализатора и выходные сигналы других датчиков (например, измерителей температуры, мембранного потенциала или др.) (14). ЭВМ снабжена внешними устройствами: алфавитно-цифровым (15) и графическим (16) дисплеями, графопостроителем (17) и печатью (18). Составной частью комплекса является пакет программ для сбора и обработки данных, а также для управления экспериментом.
В качестве основных характеристик комплекса, определяемых во многом спецификой решаемых задач и свойства-
исследуемых объектов, можно назвать: время получения усредненного доплеровского спектра с удовлетворительной
Рис. 3.12. Доплеровский спектр, полученный от живой клетки харовой водоросли со стационарным течением протоплазмы- 0=45°, т= 10 с, Г =20 °С
погрешностью (обычно в пределах 10 %) т=1—6 с- пределы измерения скоростей направленного движения к=10— —1000 мкм/с- аппаратное уширение спектра А/а=0,5— —2 Гц- локальность измерения L=100—500 мкм- возможное число каналов доплеровских измерений п=4 (кроме этого, возможен ввод в ЭВМ нескольких медленно меняющихся сигналов от других датчиков)- плотность мощности излучения в зондируемой области клетки W=l—100 Вт/см3. Точное значение порога невозмущающего воздействия устанавливается для каждого вида клеток до начала эксперимента о учетом продолжительности измерений, коэффициента поглощения и ряда других факторов.
Результаты измерений. На рис. 3.12 изображен в полулогарифмическом масштабе характерный вид доплеровского спектра, получаемого при измерениях на крупных клетках харовой водоросли Nitella, не подвергаемых внешним воздействиям. Форма этого спектра определяется главным образом распределением скоростей в измерительном объеме и свидетельствует о том, что большинство частиц движется со скоростью t>=40 мкм/с, соответствующей частоте максимума в спектре. В стационарном состоянии флуктуации скорости течения протоплазмы в этих клетках малы, так что усреднение спектра можно проводить в течение длительного времени (порядка нескольких минут), что приведет к уменьшению разброса спектральных компонентов. Однако такие измерения имеют чисто методический интерес, так как оценку скорости стационарного движения можно сделать и посредством визуального наблюдения через оптический микроскоп.
Существенно больший интерес с учетом перечисленных выше биофизических задач представляет наблюдение переходных режимов с характерным временем квазистационарности не менее 1 с. Однако при этом приходится довольствоваться значительным разбросом значений спектральной плотности мощности сигнала, приводящим к большим погрешностям в измерении.
В живых клетках Nitella нестационарные внутриклеточные движения имеют место при внешних воздействиях: световых, механических, электрических, химических и пр. Так, например, электрическая стимуляция путем подачи электрического импульса напряжением ии=100 мВ, длительностью ти=1 с на внешнюю возбудимую мембрану приводит к генерации потенциала действия и к последующей быстрой остановке потока протоплазмы с дальнейшим его восстановлением [64]. Соответствующее этому процессу изменение формы доплеровских спектров изображено на рис. 3.13.
При остановке движения (рис. 3.13а) доплеровский компонент спектра исчезает и остается лишь уширенная линия, отражающая наличие диффузионного и другого ненаправленного движения в клетке. Со временем по мере восстановления течения протоплазмы восстанавливается и доплеровский компонент спектра (рис. 3.136 — г). В зависимости от параметров внешнего воздействия время достижения исходного значения скорости потока может составлять 5—10 минут и более, причем в ряде случаев возможны длительные процессы установления, имеющие колебательный характер.
Рис. 3.14. Три примера процесса восстановления направленного течения протоплазмы в клетке после быстрой остановки (момент остановки обозначен стрелкой)
Рис. 3.13. Кинетика восстановления формы доплеровского спектра после временной остановки течения протоплазмы
Различные кинетики восстановления направленной внутриклеточной подвижности представлены на рис.3.14.
Следует заметить, что наблюдаемые колебания скорости не являются проявлением патологического состояния клетки. Периоды колебаний, постоянные для каждой конкретной клетки, принимают значения в интервале от 5 до 10 минут, причем форма колебаний может быть как квазигармонической, так и близкой к релаксационной. Интересно, что колебания скорости сопровождаются колебаниями мембранного потенциала, однако их периоды отличаются в два раза [64]. Характер восстановления скорости зависит от условий освещенности в период, предшествующий стимуляции.
Предпринимались попытки выделения на общем фоне всего рассеянного света сигнала от определенных частиц, играющих важную роль в механизме генерации движущей силы. В частности, такими частицами в соответствии с некоторыми гипотезами являются сферосомы — сферические частицы, содержащие миозин и имеющие диаметр 0,2— 0,8 мкм. Предполагается, что эти частицы совершают колебательные движения в плоскости, ортогональной направлению основного потока протоплазмы. Такие их движения должны приводить к возникновению в спектре сигнала ЛДС эквидистантных максимумов шириной, пропорциональной времени регистрации каждого спектра. Расстояние между ними по оси частот в соответствии с расчетом должно равняться средней частоте колебаний частиц. Для того чтобы отстроиться от сильного доплеровского сигнала, связанного с направленным движением протоплазмы вдоль клетки, измерения проводились так, чтобы вектор рассеяния q был ориентирован ортогонально основному потоку. Таким образом, в спектр сигнала кроме искомых компонентов вносили вклад ортогональные составляющие скорости, возникающие, возможно, при соударениях движущихся частиц, а также составляющие диффузионного движения.
На рис. 3.15 приведен доплеровский спектр, полученный по этой схеме в том же эксперименте и из того же измерительного объема, что и спектр, изображенный на рис. 3.12. Спектр построен численным методом с помощью алгоритма •быстрого преобразования Фурье по дискретным выборкам сигнала, прошедшего предварительную цифровую фильтрацию для устранения более высокочастотных компонентов, которые могли бы исказить искомые компоненты вследствие эффекта наложения частот. Разрешение по частоте составляет 0,1 Гц, время получения одного спектра — 55 с, что не превышает времени квазистационарного движения частиц в клетке.
После обработки и запоминания 90 спектров строились гистограммы значений частот, соответствующих хорошо различимым максимумам. Статистическая обработка полученных результатов, проводившаяся методами проверки гипотез, показала, что зарегистрированные максимумы статистически достоверны, причем обнаруженная дискретность в спектре со средним расстоянием между гармониками 3,6±0,6 Гц соответствует теоретическому расчету.
Рис. 3.15. Доплеровский спектр, полученный при регистрации рассеянного света в плоскости, ортогональной направлению основного потока протоплазмы
В то же время из полученных результатов пока не вытекает их явная связь с колебательным движением сферосом. Для получения такой связи необходимо было бы выделить свет, рассеянный только сферосомами, что не представляется возможным, или же исключить периодические движения других рассеивающих структур. Исследования в этом направлении продолжаются.
На основе большого экспериментального материала, полученного с помощью ЛДС, построен ряд моделей механизма генерации движущей силы, приводящей в движение протоплазму харовых водорослей [66].
Другой пример применения ЛДС для исследования нестационарной внутриклеточной подвижности относится к регистрации движения протоплазмы в слизевом грибе Physarum polycephalum [56, 59, 61, 67—70]. Этот объект существенно отличается от рассмотренного выше по морфологии, характеру подвижности и оптическим свойствам. В тяжах, представляющих собой тонкие (100—500 мкм) и длинные (1—2 см) трубочки, вследствие периодической сократительной активности стенок имеет место знакопеременное течение протоплазмы с квазипериодом Tv= 1—2 с.
На рис. 3.16 приведены три спектра, полученные от тяжей при разной скорости течения протоплазмы. Спектр 1 получен при- минимальной скорости течения, спектр 3 — при максимальной. Обращает на себя внимание существенное отличие спектров, характерных для этого объекта, от спектров, регистрируемых от клеток водоросли. Как показали расчеты и измерения на модельных капиллярах [71], форма спектров определяется не только профилем скоростей в измерительном объеме, но и статистическими параметрами оптических светорассеивающих неоднородностей стенки, ограничивающей поток. Применительно к данному объекту второй из этих факторов оказывает превалирующее влияние.
Г,КГц
Рис. 3.16. Три доплеровских спектра, полученные от плазмодия миксомицета и соответствующие разным скоростям течения протоплазмы: »(/)<» (2)
Рис. 3.17. Временная зависимость ширины доплеровского спектра, полученная от плазмодия миксомицета с челночным течением протоплазмы
Тем не менее изменение во времени этого параметра отражает кинетику внутриклеточного транспорта протоплазмы.
На рис. 3.17 приведена типичная временная зависимость модуля функции иэф (i), регистрируемая на однолучевом
спектрометре. Каждая точка этой кривой соответствует полуширине спектра, полученного в результате усреднения по 64 «мгновенным» спектрам, с общим временем измерения 5 с.
Заметим, что подобные кривые, получаемые методом ЛДС, и качественно, и количественно соответствуют данным, получаемым путем визуальных измерений и киносъемки через оптический микроскоп, однако отличаются большим разрешением и не содержат элементов субъективности. Важным является также то, что обработка и представление данных осуществляются в реальном масштабе времени и по окончании эксперимента кривые хранятся в памяти ЭВМ в виде массивов чисел, готовых к последующей дополнительной обработке.
Анализ подобных кривых, полученных при различных условиях проведения эксперимента, в том числе в результате многоточечного зондирования на многоканальном варианте спектрометра [8, 56], дал большую информацию, которая использована при построении моделей внутриклеточной подвижности [66, 68, 72, 731. В частности, исследовано влияние квазистационарных и импульсных температурных воздействий, изменяющих период колебаний скорости потоков Tv, показаны возможности синхронизации этих колебаний внешним воздействием [2, 69], получены данные о возможной природе фактора, синхронизующего внутриклеточные осцилляторы (задатчики ритма) [8, 67], показано наличие активной сократительной работы тяжей, приводящей в движение протоплазму, [68] и т. д.
Лазерная доплеровская микроскопия. В приведенных выше примерах применявшийся для измерений спектрометр обеспечивал локальность зондирования около 100 мкм, что было достаточно в связи со сравнительно большими размерами исследованных объектов. При работе с маленькими клетками необходимо более высокое пространственное разрешение — порядка нескольких микрометров. Этого удается достичь в так называемых лазерных доплеровских микроскопах (ЛДМ) благодаря использованию короткофокусной оптики и специальной геометрии расположения элементов [74—84]. В большинстве случаев ЛДМ выполняют на базе серийных оптических микроскопов, что делает их компактными, легко настраиваемыми приборами.
На рис. 3.18 приведена блок-схема ЛДМ, выполненного на основе микроскопа «Люмам» (1), сопряженного с микро- ЭВМ (2) и снабженного для удобства настройки телекамерой (3) и телемонитором (4) [84]. Конструкция микроскопа позволила реализовать как дифференциальную, так и однолучевую схемы (путем перекрытия одного из пучков) с подведением зондирующих пучков к объекту либо снизу (/), либо сверху (//). В первом случае фотоприемник (5) регистрирует свет, рассеянный вперед, во втором — назад.
Рис. 3.18. Блок-схема лазерного доплеровского микроскопа
Измерительный объем формируется фокусирующим (б) и приемным (7) объективами и точечной диафрагмой (8), расположенной перед фотоприемником в плоскости изображения. Так, при увеличении объективов 15 х и 30 х и размере диафрагмы 150 мкм продольный размер измерительного объема ALj=7,5 мкм, а поперечный AL2=2,5 мкм. Масштабный коэффициент, связывающий измеряемую скорость с доплеровским сдвигом частоты, составляет 1,3 мкм/(с*Гц).
До попадания на фокусирующий объектив оба пучка проходят через управляемые акустооптические модуляторы (9),
в результате чего они приобретают относительный сдвиг частоты Л/, который может регулироваться в пределах от 102 до 105 Гц. Наличие разности частот у зондирующих пучков делает ЛДМ чувствительным к направлению исследуемого потока и позволяет отстроится от малоинформативных низкочастотных компонентов доплеровского сигнала [14].
Схема обработки фототока после усилителя (12) включает в себя анализатор реального времени типа С4-72 (13) и/или ЭВМ (2), снабженную дисплеем (15), дисководами с гибкими магнитными дисками (16) и плоттером (17). Сигнал на ЭВМ подается после дискретизации через интерфейсные блоки (14), выполненные в стандарте КАМАК- Микроскоп снабжен также видеомагнитофоном (18) для записи телеизображений объекта.
Описанный ЛДМ предназначен главным образом для исследования направленных движений в клетках, однако он имеет более широкую область применений.
С помощью лазерных доплеровских микроскопов получен целый ряд уникальных результатов. В частности, зарегистрировано направленное движение частиц внутри одиночных соматических клеток [82], проведено прямое наблюдение накопления б-кристаллина в хрусталиках эмбриона цыпленка [83]. На фоне интенсивного направленного течения протоплазмы в клетках водоросли обнаружена анизотропия коэффициента трансляционной диффузии частиц по разным направлениям внутри клетки [80, 81].
Эти и целый ряд других результатов показывают, что ЛДС и ЛДМ уже стали эффективным средством, способным решать широкий круг задач клеточной биофизики.
