Диагностика биологических объектов на основе измерения коэффициентов диффузии - лазерная диагностика в биологии и медицине

Диагностика биологических объектов
на основе измерения коэффициентов диффузии
Трансляционная диффузия. К настоящему времени наибольшее число работ по применению лазерной спектроскопии квазиупругого рассеяния в биологии относится к диагностике макромолекул: белков, нуклеиновых кислот, их фрагментов и комплексов, а также различных надмолекулярных и клеточных структур, вирусов, фагов. В табл. 3.1 приведены некоторые характерные примеры результатов значений гидродинамического радиуса некоторых биологических частиц, взятых из работ [1, 3, 9]. Все измерения проводились с помощью монодинных спектрометров. Обращает на себя внимание малая погрешность измерений, составляющая около 1%. Случаи большей погрешности при исследовании стационарных объектов связаны, как правило, не с ошибкой метода, а с недостаточной очисткой образца. Наличие в нем посторонних частиц (например, пылинок) или. агрегатов приводит к увеличению погрешности.
Таблица 3.1
Коэффициент трансляционной диффузии и гидродинамический радиус некоторых биологических макромолекул

Измерение стационарных значений коэффициентов диффузии, гидродинамических радиусов и даже массы не является конечной целью диагностики. Эти параметры очень чувствительны к изменениям условий окружающей среды (раствора). Поэтому в большинстве работ регистрируются изменения параметров DT и ггл в целях диагностики различных изменений свойств частиц под действием внешних факторов. К таким изменениям относятся: денатурация, агрегация, иммунные реакции, конформационная подвижность и др.
Изменение DT частиц в растворе может происходить даже под действием зондирующего пучка [17]. Это относится главным образом к сильно поглощающим свет растворам, примером которых является раствор гемоглобина. Измерения, проводившиеся на монодинном спектрометре при угле рассеяния 0=90° с обработкой сигнала на 20-канальном анализаторе спектра реального времени с погрешностью определения DT не выше 0,5 %, позволили получить методически важные зависимости полуширины лоренцевского спектра от мощности зондирующего пучка для молекул гемоглобина с разной степенью оксигенации (рис. 3.5). Видно, что, экстраполируя полученные зависимости в сторону меньших интенсивностей зондирующего пучка, получают такое значение интенсивности, при котором можно проводить измерения, не внося изменений в исследуемый объект.

Рис. 3.5. Зависимость ширины спектра сигнала МС от мощности зондирующего пучка при измерении в растворах деоксигемоглобина (1) и оксигемоглобина (2) [17]
Кинетику обратимых изменений коэффициента диффузии молекул гемоглобина при их агрегации в комплексы вследствие деоксигенации удается регистрировать даже не в растворе, а внутри интактных красных клеток крови — эритроцитов [18]. Для этого используется спектрометр, выполненный на базе серийного микроскопа, позволяющий осуществлять корреляционную спектроскопию флуктуаций интенсивности в объеме около 8 мкм3. На таком микроскопе- спектрометре наблюдалась агрегация гемоглобина в эритроцитах крови больных серповидной анемией, движение протоплазмы внутри очень маленьких (около 10 мкм) живых клеток (об этом подробнее см. 3.5). Подобная аппаратура` может быть с успехом использована, например, при изучении процессов, происходящих с изменением размеров белков в процессе биосинтеза и при дифференциации клеток.
Представляет интерес изучение зависимости агрегации молекул от температуры. Сильная температурная зависимость скорости роста агрегатов была показана, например, при исследовании процессов агрегации мономеров иммуноглобулина [19]. При 39 °С никакого изменения радиуса- мономеров (5,8 нм при концентрации 15,4 мг/мл) не наблюдалось даже в течение 60 часов. В то же время радиус агрегатов достигал 100 нм за 4 часа при нагревании раствора до 62 °С.
Измерение кинетики полимеризации тубулина и самосборки микротрубочек in vitro при квазистатическом изменении температуры показало [20], что при концентрации тубулина в растворе 1,1 мг/мл средний коэффициент диффузии >т начинает резко, но обратимо уменьшаться при температуре 20—25 °С. При этом начинает обратимо увеличиваться полидисперсность. Существенные и уже необратимые изменения раствора начинаются в диапазоне температур 45—60 °С, что, по-видимому, свидетельствует о денатурации белка. Скачкообразное повышение температуры с 7 до 37 °С приводит к изменению >т и степени полидисперсности более чем в три раза за 20 минут. Добавление в раствор 100 мкмоль колхицина, препятствующего полимеризации, делает раствор не чувствительным к температуре.
Другим примером применения метода для исследования реакции полимеризации, имеющим большое значение в биомедицинской диагностике, является переход фибриногена в

Рис. 3.6. Временные зависимости интенсивности светорассеяния (1) и гидродинамического радиуса молекул фибриногена (2) после добавления в раствор тромбина (в момент времени t—0)
фибрин и агрегация фибрина. При появлении на теле раны устойчивые молекулы фибриногена при участии фермента тромбина переходят в неустойчивую форму, называемую фибрином. Фибрин начинает полимеризоваться с образованием плотной сетки агрегатов, способствующей заживлению раны.
На рис. 3.6 в полулогарифмическом масштабе изображена временная эволюция средней интенсивности рассеянного света Iv(t) и среднего гидродинамического радиуса ггд (t) молекул фибриногена в растворе с концентрацией 1 мг/мл после добавления 0,0033 ед/мл тромбина. Измерения проводились на МС с 60-канальным фотонным коррелятором, сопряженным с ЭВМ, при 0=90°, 7=37 °С. Исследование кинетики этой реакции вплоть до перехода в гель- состояние (через 6 часов) позволило построить модель взаимодействия молекул и всего процесса полимеризации [21].
Еще один немаловажный пример относится к диагностике глазных заболеваний. На основе теории упругого светорассеяния было показано, что помутнение хрусталика глаза происходит из-за рассеяния света на конгломератах высокомолекулярных протеинов [22, 23]. К настоящему времени с помощью спектроскопии квазиупругого рассеяния проведены многочисленные исследования диффузионной подвижности протеинов в хрусталиках человека и животных как in vitro, так и in vivo [24, 25]. При исследованиях на объектах in vitro рассеянный свет Не—Ne лазера (^= =632,8 нм) мощностью 1—5 мВт собирался под углами 45 или 90° на ФЭУ, откуда поступал на цифровой коррелятор, содержащий не менее 100 каналов, и далее на ЭВМ для последующей обработки корреляционной функции.
Обнаружено, что в нормальном хрусталике глаза человека основными рассеивателями являются конгломераты протеинов диаметром около 0,5 мкм и полидисперсным набором частиц с диаметрами от 1 до 6 мкм [26, 27]. В работе [28] проведено изучение распределения конгломератов протеинов в хрусталиках свиньи. Показано, что средний диаметр частиц первого компонента распределения составляет 15—23 нм, второго — около 0,1 мкм, третьего — около 1 мкм и, наконец, четвертого — 30—70 мкм. При этом распределение каждого типа конгломератов по объему хрусталика носит довольно сложный характер.
Таким образом, методом динамической спектроскопии можно наблюдать за изменением структурного состава хрусталика, проявляющегося в изменении его светорассеивающих свойств. Однако следует заметить, что для получения надежных результатов при мощности зондирующего излучения около 1 мВт время измерения во всех экспериментах составляло от нескольких до десятков минут, что является совершенно неприемлемым в клинической практике. Поэтому необходимы дальнейшие исследования с целью повышения чувствительности метода.
В качестве примера исследования кинетики агрегации в процессе иммунологической реакции можно привести изучение реакции агглютинации, проводимое для экспрессного определения содержания бактерий [29]. Если при визуальном контроле первое наблюдение этой реакции регистрируется через 18 часов, то с помощью фотон-корреляционного спектрометра уже через несколько минут можно увидеть начало прогрессирующего уменьшения крутизны спадания корреляционной функции, свидетельствующего об увеличении среднего размера частиц и, следовательно, о протекании реакции.
Использование фотон-корреляционной спектроскопии позволяет также измерять распределения по размерам образующихся агрегатов бактерий, в том числе и при разведениях, больших титра, уже на первичных стадиях реакции, т. е. при агрегации всего двух или нескольких бактерий. Очевидна важность прикладного аспекта этих работ. Подобные исследования проводятся также при изучении и таких иммунологических реакций, как реакция преципитации [30] и реакции антиген — антитело [31].
Вращательная диффузия. Во всех рассмотренных примерах речь шла об измерении коэффициента трансляционной диффузии. Однако в тех случаях, когда форма рассеивающих частиц ближе не к сферической, а к аксиально симметричной или же сферические частички сильно анизотропны, в спектр флуктуаций рассеянного поля, как уже говорилось, вносит вклад также ориентационная, или вращательная, динамика. Это отражается на корреляционной функции таким образом, что она раскладывается в ряд экспонент, в показатели которых кроме DT входит также DB — коэффициент вращательной диффузии. При определенном выборе угла рассеяния число значащих членов ряда можно редуцировать до двух, что дает возможность вычислить по экспериментальной кривой коэффициентов [1, 9].
Другой способ измерения DB состоит в регистрации спектра флуктуаций интенсивности деполяризованного компонента рассеянного света [32]. Это связано с тем, что именно при рассеянии на анизотропных частицах возникает этот компонент. Регистрируя деполяризованный свет при малых углах рассеяния, когда вклад трансляционной диффузии ничтожно мал (выражение (3.4)), можно измерить DB с большой точностью. Естественной трудностью в этом подходе является то, что интенсивность деполяризованного компонента рассеянного света обычно на несколько порядков ниже интенсивности поляризованного компонента. Однако применение техники счета фотонов делает это обстоятельство не очень важным. Совместные измерения
DT и DB дают дополнительную информацию о форме рассеивающих частиц.
Кроме вращения анизотропных макромолекул определенный вклад в спектр сигнала вносят быстрые конфигурационные внутримолекулярные движения: изгибные колебания длинных молекул или филаментов, динамика полимерных клубков и т. д. Методы расчета спектров рассеянного света, учитывающие эти движения, в настоящее время усиленно развиваются [9]. Получаемые параллельно экспериментальные данные используются для проверки различных гипотез и моделей.