Проточные анализаторы микрочастиц - лазерная диагностика в биологии и медицине
Видео: Хайдуков С. В. ИССЛЕДОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
Видео: Проточный цитометр изнутри. Inside the flow cytometer.
Проточные анализаторы микрочастиц
Общие сведения. В лабораторно-диагностической практике при работе с биологическими жидкостями, содержащими частицы неорганического или органического происхождения, исследователей обычно в первую очередь интересуют концентрация, состав и размеры частиц. Эти вопросы, как правило, возникают при анализе крови, семенной жидкости, осадков мочи и т. п. К медицинскому анализатору микрочастиц предъявляются специфические требования, основные из которых — малый объем пробы, высокие концентрации и полидисперсность размеров анализируемых частиц. В настоящее время выпускается значительное число приборов для определения концентрации микрочастиц в жидкостях [П. 48, 50]. Однако приборов, пригодных для применения в медицинской практике, известно сравнительно немного.
Оптические методы исследования биологических жидкостей могут основываться на явлениях дифракции, ослабления света, на основе изображающей техники и др. Чаще всего на основе ослабления света строятся анализаторы, существенные достоинства которых — широкий диапазон регистрируемых размеров, отсутствие предварительной обработки изучаемой пробы. Для этого определяется отклик фотоприемника, регистрирующего микрочастицы по интенсивности светорассеяния, с учетом углов сходимости падающего и приемного световых пучков. В зависимости от значения угла наблюдения 0 реализуются различные способы измерений: при 0=0° говорят о фотометрических методах исследования, если углы наблюдения близки к нулю, по прямой свет не учитывается, то реализуются малоугловые или дифракционные методы, при 180° имеем лидарные методы. Для биологических исследований используется чаще всего малоугловой способ регистрации излучения.
Характеристики лазерных анализаторов частиц. В СССР разработан и серийно выпускается прибор АМПЛ-1 (анализатор микрочастиц проточный лазерный), основанный на методе определения размеров микрочастиц по интенсивности малоуглового светорассеяния [511. Прибор предназначен для определения концентрации микрочастиц в суспензиях, построения и анализа гистограмм распределения микрочастиц по размерам при помощи микро-ЭВМ.
Функциональная схема прибора приведена на рис. 2.7, где изображены устройства ввода буферной жидкости (БЖ), ввода пробы (П), оптико-электронного блока (ОЭ) и системы электронной обработки информации (ЭО). Исследуемый препарат подается из шприца 13 устройства П вместе с буферной жидкостью из емкости 1 устройства БЖ в проточную камеру 2 с плоскими окнами блока ОЭ. Луч Не—Ne лазера (Х=632,8 нм) 9 фокусируется линзой 10 в измерительный счетный объем 11 диаметром 100 мкм, через который последовательно пролетают частицы, генерируя импульсы светорассеяния. Прямое нерассеянное излучение подавляется фильтром-ножом Фуко 12. Сигнал с фотоприемника 5 поступает на многоканальный анализатор амплитуды импульсов 7 и далее на микро-ЭВМ 8 системы электронной обработки информации ЭО. Управление режимом анализа пробы осуществляется с помощью блока сопряжения 6,
сигнал с которого управляет двигателем привода 3 дозатора 13 с помощью специальной электронной схемы 4 блока П1. Объем анализируемой пробы составляет 20—500 мм3 при расходе буферной жидкости 1 см3/с.
Рис. 2.7. Блок-схема анализатора АМПЛ-1 [П. 51]
Большое внимание уделено конструкции проточной камеры с гидродинамической фокусировкой потока с исследуемой жидкостью и анализом ее в воздухе. Плоские окна проточной камеры позволяют избежать нежелательной рефракции от стеклянных трубок, обычно используемых в подобных системах. Наибольшие ошибки в определении гистограмм распределений микрочастиц вызываются неравномерностью интенсивности лазерного излучения, смещением зонда относительно центра струи с пробой вследствие тоге, что частицы, проскакивающие через различные области измерительного объема, находятся в различных условиях освещения. Диапазон размеров измеряемых частиц от 0,5 до 100 мкм, максимальная скорость счета — 10 с.
Погрешность измерения прибором концентрации поли- стиролового латекса диаметром 4,1 мкм составляет 10— 15 %. Тем не менее следует отметить, что данному прибору присущ ряд недостатков, которые характерны для методов регистрации интенсивности с помощью малоуглового светорассеяния. Основной из них — это зависимость результатов измерений от показателя преломления исследуемого объекта, что особенно имеет место при где рабочие характеристики счетчиков частиц максимально подвержены осцилляциям (появление участков типа плато или впадин) [50]. Это может приводить к тому, что рабочие характеристики могут быть неоднозначными (особенно в диапазоне 0,5—2,0 мкм). Поэтому в этих случаях необходимо иметь априорную информацию об исследуемом объекте и использовать калибровочные кривые.
В работе [52] описан лазерный анализатор биологических жидкостей, также построенный на основе регистрации света, рассеянного объектами. Однако в отличие от вышеописанного прибора свет регистрируется в узком угле, равном 20°, а угол наблюдения 0=30°. Такая схема позволяет уверенно регистрировать частицы с относительным показателем преломления в диапазоне 1,01—1,50. Сигнал с фотоприемника регистрируется также анализатором амплитуды. Для гидродинамической фокусировки исследуемой жидкости используется камера со стеклянной трубкой, которая хотя и является наиболее простой из известных камер, но обладает повышенными требованиями к качеству изготовления малого внутреннего диаметра и оптическим характеристикам материала. Размер измерительного объема составляет 200 мкм. Проведенные экспериментальные исследования прибора показали, что надежно можно регистрировать частицы с размерами, большими 1 мкм, при диапазоне измеряемых концентраций 10*—5-106 мл-1. Проведены исследования на разведенных суспензиях биологических объектов размерами 3—10 мкм.
Следует заметить, что для данного типа счетчиков частиц показания прибора будут сильно зависеть от показателя преломления исследуемого объекта и в диапазоне 1—2 мкм возможно появление на рабочих характеристиках участков типа плато или впадин, т. е. также необходимо иметь априорную информацию об исследуемых объектах.
Многопараметрическая пролетная цитометрия. В серии работ [53] развивается многопараметрический подход к лазерной пролетной цитометрии, основанный на светорассеянии, иногда в сочетании с микрофлуориметрией. Одновременно измеряется ряд сигналов от отдельной клетки, например интенсивности рассеяния вперед и под углом 90°- полная интенсивность ортогонального рассеяния и интенсивность его компонента, поляризованного в плоскости, перпендикулярной плоскости поляризации падающего излучения и направлению пролета клеток, так называемого деполяризованного компонента, Iх`, интенсивности рассеяния в диапазонах углов 1,0—2,6° и 3,0—11,0°- интенсивности бокового рассеяния излучения двух длин волн. Возможны и другие комбинации сигналов.
Такой подход позволяет довольно эффективно дифференцировать клетки крови по их морфологии. Например, эозинофильные гранулоциты могут быть отделены от нейтрофильных гранулоцитов. Такая возможность важна как для практики, так и для теоретических исследований в области- иммунологии. В этом случае информация о типе клетки определяется соотношением интенсивности ортогонального рассеяния и ее деполяризованного компонента. При этом абсолютные значения коэффициента деполяризации /j_/(/_l+/ii) при большом разбросе углов приема рассеянного излучения (14,5°) имеют следующие значения: 0,044 (эозинофильные гранулоциты)- 0,013 (нейтрофильные гранулоциты)- 0,007 (моноциты)- 0,008 (лимфоциты). Важно, что эозинофилы, имеющие большое число малых внутриклеточных частиц (гранул, дают относительно большие коэффициенты деполяризации. Это подтверждает тот факт, что в процессе деполяризации излучения не последнюю роль играет многократное рассеяние.
С точки зрения аппаратурной реализации многопараметрическая цитометрия может быть осуществлена с помощью стандартных пролетных цитометров с прямоугольным кварцевым капилляром или струей на воздухе при облучении светом лазеров небольшой интенсивности (например, Не—Ne, Аг (100 мВт)), включая многоволновые лазеры, или светом спектральных ламп (ртутная лампа) при небольшой модификации цитометра для приема рассеянного излучения.
Важно, что результаты измерений представляются в виде двухпараметрических карт на экране дисплея микро- ЭВМ, отражающих плотность пространственно разделенных областей зафиксированных клеток различных типов. Очевидно, что возможно и трехмерное представление результатов при одновременном измерении трех параметров рассеяния. В этом случае следует ожидать еще большей дифференциации клеток.
Двухпараметрические карты интенсивности ортогонального рассеяния и рассеяния вперед растворенных клеток крови человека показывают с хорошим разрешением области рассеяния гранулоцитами, моноцитами, лимфоцитами и эритроцитами с остатками клеток. Аналогичное разделение возможно при одновременном наблюдении бокового рассеяния на длинах волн 405 и 577 нм. В данном случае разделение области отклика цитометра на лимфоциты и моноциты от области отклика на эритроциты обусловлено малой интенсивностью рассеяния излучения с Х=405 нм эритроцитами.
Построенный авторами [53] простой пролетный цитометр на базе Не—Ne лазера мощностью 5 мВт с одновременной регистрацией четырех параметров рассеяния оказался вполне надежным прибором для дифференциального счета четырех типов белых клеток крови. Сравнение результатов счета, выполненных на этом приборе, и с помощью выпускаемого промышленностью пролетного цитометра «Technicon Н-6000», показало хорошую их корреляцию. Коэффициент корреляции оказался равным: 0,99 для лимфоцитов, 0,76 для моноцитов, 0,99 для нейтрофильных гранулоцитов и 0,98 для эозинофильных гранулоцитов. Отметим, что промышленные цитометры являются довольно сложными приборами, требующими предварительной цитохимической подготовки объекта исследования.
В [531 показана перспективность развитой методики измерений и анализа результатов для экспресс-диагностики различных видов лейкемии. При этом наибольшая информация может быть получена из одновременных измерений характеристик светорассеяния и иммунофлуоресценции.
