Области применения калориметрических методов - лазерная диагностика в биологии и медицине
Видео: Блок биоуправления Матрикс БИО
5.6. Области применения калориметрических методов
Общие сведения. Высокая чувствительность, возможность получения значительного разрешения при использовании лазеров в качестве источников излучения, локальность анализа, применимость для исследования веществ в различных агрегатных состояниях и в малых объемах, простота обработки результатов и возможность автоматизации делают ОА метод и другие калориметрические методы исследования уникальными с точки зрения диапазона их применений в биологии и медицине. Они применяются: при газовом анализе, необходимом для контроля процессов дыхания и питания животного мира, микроорганизмов и растений- анализе загрязнений атмосферы и гидросферы, необходимом для санитарного контроля окружающей среды- анализе лекарственных препаратов и биологических сред в виде порошков и тонких пленок- контроле фотохимических и биохимических реакций- изучении фотохромных биологических сред- изучении эффективности фотосинтеза с целью ранней диагностики урожайности сельскохозяйственных культур- в лабораторной медицинской диагностике- оптико-акустической микроскопии- в офтальмологии и дерматологии.
Газовый анализ. Выделение разнообразных газов в процессе жизнедеятельности человека, микроорганизмов и растений является важнейшим показателем характера протекания соответствующих биохимических реакций. Поэтому контроль состава и концентрации выделяющихся газов представляет важную задачу в биохимических исследованиях, а также в диагностике некоторых заболеваний. Задача газового анализа сводится к анализу многокомпонентной смеси газов, имеющих, как правило, малые коэффициенту поглощения в видимой и ближней ИК областях спектра. Применение метода абсорбционной спектроскопии в данном случае требует длины столба газа в несколько десятков и сотен метров, что в биологическом эксперименте обеспечить трудно. Требуется также высокое спектральное разрешение для разделения вклада отдельных компонентов в спектры поглощения.
Эти проблемы исключаются при использовании ОА метода, в котором в качестве источников света применяют перестраиваемые лазеры. В ИК области спектры поглощения паров воды, окиси азота, метана регистрируются с помощью, дискретно перестраиваемых DF (3,5—4 мкм) и С02 (9,1—3 мкм) лазеров. При исследовании многоатомных молекул видимая область спектра интересна с точки зрения определения их концентрации в многокомпонентной смеси. Она формируется за счет колебательных обертонов высокого порядка, и поэтому интенсивность поглощения чрезвычайно мала. Методом внутрирезонаторной ОА спектроскопии, обеспечивающим частичное разрешение вращательной структуры полос колебательного поглощения (1 см-1), при использовании лазеров на красителях удается получить наиболее полные спектры обертонного колебательного поглощения (вплоть до 7—9 порядков) таких многоатомных молекул, как НС1, небольших органических молекул типа C0H(i, модификаций метанола СН3ОН, CH3OD и SiHD3 в газовой фазе.
Показана возможность исследования паров азулена с помощью ОА кюветы, которая показана на рис. 5.66, с высокой точностью, определяемой шириной линии генерации импульсного лазера на красителях с ламповой накачкой, и высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать ОА спектры даже при комнатной температуре при длине пути поглощения всего 1 мм. Ранее для получения спектра поглощения азулена в паровой фазе с той же чувствительностью и меньшим разрешением требовалась длина пути поглощения, равная 4 м.
В ОА спектроскопии существуют и другие подходы к решению задачи газового анализа. Например, перспективным является сочетание О А метода и метода газовой хроматографии, обеспечивающего предварительное разделение компонентов исследуемой смеси на отдельные фракции. Высокая эффективность ОА детектирования в газовой хроматографии продемонстрирована на примерах селективного анализа изомеров бутилового спирта и ксилолов, определения содержания трансизомеров жирных кислот в образцах пищевых жиров, детектирования гербицидов и пр. [П. 42].
В другом подходе используются специфические особенности ОА метода, заключающиеся в изменении ОА сигнала в зависимости от параметров буферных газов (непоглощающих газов): их молекулярного веса, изотопного состава, теплоемкости, теплопроводности и вязкости. Обычно для этих целей применяют резонансные спектрофоны, для которых свойства буферных газов проявляются в смещении резонансной частоты, обусловленном изменением скорости звука в смеси, и изменении добротности акустического резонатора за счет различных механизмов затухания в буферных газах.
Анализ загрязнений атмосферы и микропримесей в жидкостях. При анализе загрязнений атмосферы в полной мере реализуются такие достоинства ОА метода, как высокая чувствительность и чрезвычайно широкий динамический диапазон. Для газов, присутствующих в атмосфере, динамический диапазон составляет 10-7—10-1 при длине кюветы 10 см. Нижний предел определяется чувствительностью спектрофона, а верхний — процессами насыщения. Такой динамический диапазон позволяет с помощью одного и того же устройства регистрировать как следы веществ, загрязняющих атмосферу (малые уровни), так и источники загрязнения (большие уровни).
Поскольку ОА метод позволяет регистрировать загрязнения в ограниченном объеме (локально) и в реальном масштабе времени, то обеспечивается возможность анализа динамики поступления и ухода примесей в исследуемом объеме. Например, многоволновой газоанализатор на основе внутрирезонаторной ОА спектроскопии с использованием СО, С02 и Не — Ne (А.=3,39 мкм) лазеров и модуляцией длины волны (для устранения фоновых сигналов) имеет пределы обнаружения примесей индустриальных загрязнений атмосферы (NO, N02, NH3, С2Н4, 2jCnH2&bdquo-+2) в пределах 0,1—103 ppb, динамический диапазон 10*—105 [11]. С помощью компактного волноводного СОг лазера с поперечной ВЧ накачкой можно обеспечить диагностику загрязнений от гидразивного топлива и токсичных индустриальных веществ на уровне 1—100 ppb [П. 46].
Отсутствие плавно перестраиваемых лазеров с достаточной выходной мощностью в ИК области спектра (2—15 мкм) несколько сдерживает широкое внедрение в практику ОА метода анализа загрязнений атмосферы. В связи с этим перспективными считаются методы нелинейной фотоакустической спектроскопии. Этими методами определены пороги обнаружения газов: СН4, С02, N02 и С2Н3С13 в атмосфере- они находятся в пределах 1—10ррш.
Применение ОА метода перспективно также и для определения микропримесей в жидкостях. Используются лазеры как непрерывного, так и импульсного действия. При работе двухволнового Аг лазера и жидкостной ячейки (типа представленной на рис. 5.6в) удалось зарегистрировать следы Р-каротина в хлороформе на уровне 12 ppt (0,08 нг/мл). Аналогичная ячейка и Аг лазер (514,5 нм) мощностью 0,5 Вт использовались для детектирования малых концентраций на уровне 14 ppt (0,02 нг/мл) Cd в пенициллине после его экстракции в хлороформ, а также для анализа малых концентраций канцерогенных пищевых красителей в воде, 2,75-10-8моль/л (0,7 ppb). Предел обнаружения витамина А в экстрактах из крови при использовании импульсного азотного лазера (337,1 нм) составляет около 1 ppt (2 пг/мл).
Импульсный метод в принципе имеет более высокую чувствительность. Однако, чтобы ее реализовать, необходим специальный растворитель. Вода оказывается не лучшим растворителем, поскольку довольно значительно поглощает свет даже в видимом диапазоне длин волн. Импульсные азотные лазеры, а также лазеры на красителях, успешно применяются для определения малых концентраций различных порфиринов, красителей, лекарственных препаратов, включая наркотики и витамины, на уровне 0,09— 1 ppb. В качестве растворителей используется вода, этанол, гексан, СС14 и др., а в качестве детекторов — наиболее простые кюветы (рис. 5.6г) или акустический зонд (рис. 5.6д). Результаты измерений в виде предельных концентраций анализируемых веществ представлены в табл. 5.2 (см. [П. 23]).
С помощью ОА ячейки, изображенной на рис. 5.6г, удается обеспечить предельно обнаружимые концентрации ионов актиноидов в водных растворах на уровне 8-10-7— 7• 10-8 моль/л. Эта задача возникает в связи с проблемой захоронения ядерных отходов.
Высокоэффективная колончатая жидкостная хроматография в сочетании с лазерной ОА спектроскопией позволяет получать чувствительность на уровне 1 ppt при обнаружении витамина А в биообразцах [П. 42].
Анализ аэрозолей, мутных и коллоидных растворов. ОА диагностика аэрозолей, мутных и коллоидных растворов важна для качественного и количественного анализов загрязнений атмосферы и гидросферы микрочастицами природного и промышленного происхождения, для контроля за ходом разнообразных биохимических реакций, поскольку по сравнению с традиционно используемым для этих целей абсорбционным методом она дает возможность определять малые концентрации микрочастиц, обеспечивает локальность измерений и высокую точность за счет малого влияния эффектов светорассеяния [П. 41, П. 43].
Таблица 5.2
Предельные концентрации различных красителей, лекарственных препаратов и витаминов, регистрируемых ОА методом с помощью импульсного N2 лазера (337,1 нм) при температуре 298 К
Вещество | Растворитель | Чувствительность, |
Бактериохлорофилл-а Видео: ПБК: Открыли единственную в Балтии лабораторию по выращиванию стволовых клеток | этанол | 1,0 |
Билирубин | » | 20 |
Бнливердин | вода | 0,9 |
Хлорофилл-а | этанол Видео: В Кирове открылась лаборатория фармацевтической биотехнологии (ГТРК Вятка) | 0,9 |
Хлорофилл-6 | » | 0,3 |
Хлорофилл (водный золь) | вода | 5,0 |
Хлорофиллин | » | 3,0 |
Копропорфирин III тетроэтил эфир | этанол | 2,0 |
Кумарин 120 | » | 1,0 |
Цитохром С | вода | 30 |
Эозин | » | 4,0 |
Флуоресцеин двунатриевый | » | 3,0 |
Гематин | » | 1,0 |
Гематопорфирин | этанол | 0,3 |
Гемоглобин | вода | 70 |
Мезопорфирин IX диметиловый эфир | этанол | 0,5 |
Оксазин перхлорат | » | 3,0 |
Протопорфирин IX диметиловый эфир | 0,09 | |
Протопорфирин двунатриевый | вода | 1,0 |
Родамин-бЖ | » | 2,0 |
Рибофлавин | » | 10 |
Тетрафенилпорфин | любой | 6,0 |
Уропорфирин I этиловый эфир Витамин В12 | этанол | 2,0 |
Анализ атмосферных аэрозолей ОА методом можно проводить непосредственно в газовом потоке или с предварительной их концентрацией на специальных фильтрах. В качестве источников излучения используют С02, Аг, Не — Ne, AHr:Nd и HF лазеры, а также лазеры на красителях. Применяют резонансные и нерезонансные спектрофоны, дифференциальные схемы с двумя спектрофонами, калибровку осуществляют по эталонному молекулярному поглощению в газе. Исследовались аэрозоли в виде атмосферной, асбестовой и кварцевой пыли, ацетиленовых, дизельных и сигаретных дымов, выхлопов автомобильных двигателей. Характерные размеры частиц 0,15—3 мкм, порог обнаружения составляет 10-в г/м8 на =514,5 нм (ацетиленовые и дизельные дымы).
Анализ коллоидных растворов на примере количественного определения частиц BaS04 в воде показывает значительный динамический диапазон ОА метода (почти три порядка величины) и его высокую чувствительность 5 нг/мл (30 ppb). Применение ОА зонда, подобного представленному на рис. 5.65, при импульсном его возбуждении излучением лазера на красителях позволяет изучать седиментацию частиц молекулярных или макроскопических размеров в гравитационном поле или в центрифуге. Например, при исследовании седиментации гуминовых кислот удается определять динамику осаждения частиц разных размеров (0,08— 0,5 мкм) [12]. С помощью спектрофона, изображенного на рис. 5.7в, можно регистрировать отдельные частицы пыли в сверхчистых растворителях.
Анализ лекарственных препаратов и биологических сред в виде порошков и тонких пленок. Основные достоинства ОА метода — высокая чувствительность и возможность работы в условиях значительного рассеяния света — реализуются при изучении поглощения света в средах в виде порошков твердых тел и тонких пленок жидкостей. Наиболее чувствительные из рассмотренных выше методов регистрации ОА сигнала позволяют измерять поглощение света на уровне 10-8—10~ следовательно, для веществ с коэффициентом поглощения порядкаада10`*—102см-1 можно регистрировать молекулярный монослой поглощающего вещества (l = 10-8 см).
Для анализа порошков необходим тщательный выбор технических условий эксперимента, способствующих устранению влияния рассеянного излучения. Желательно, чтобы исследуемый образец был оптически достаточно тонким и не поглощал весь падающий на него свет, в противном случае появляется неопределенность в характере зависимости интенсивности света от глубины его проникновения в образец, обусловленная как эффектом сильного рассеяния (увеличение интенсивности в верхних слоях образца), так и эффектом насыщения и влиянием частоты модуляции.
Указанные недостатки устраняются при использовании ОА детектора (рис. 5.6е), допускающего размещение порошка в виде тонкого слоя толщиной несколько микрометров между двумя кварцевыми пластинами. Для уменьшения рассеяния порошок предварительно размешивают в капле вязкой жидкости, имеющей показатель преломления, близкий к показателю преломления вещества порошка, масса освещаемого порошка менее 0,1 мкг.
Фазовый метод в сочетании с жидкостной ячейкой открытого типа позволяет раздельно измерять объемное и поверхностное поглощение в жидкостях на границе с поверхностью твердого тела. В частности, изучать кинетику процессов абсорбции и десорбции молекул на поверхности, а также исследовать характер протекания фотохимических реакций, если они сопровождаются изменением поглощения жидкости твердым телом (подложкой). Такая возможность была продемонстрирована на примере молекул S-2160 (трипептид), используемых при измерениях ферментативной активности веществ (см. [П. 23]).
ОА метод используется для получения ИК спектров поглощения фармацевтических таблеток, в том числе аспирина различного производства. Так же как и спектры диффузного отражения, ОА спектры в ближней ИК области применяются для определения содержания белка, жира и влаги в семенах подсолнечника и соевых бобах. С помощью газомикрофонной ячейки, Аг и Кг лазеров, работающих на линиях с =457,9- 488,0- 514,5 и 647,1 нм, удалось надежно определить примеси различных веществ в кофейном порошке: измельченного обожженного пергамента (13,8 %), ячменя (16,6 %) и кукурузы (15,1 %) [13].
Перспективно применение ОА метода в тонкослойной хроматографии [П. 41, П. 43]. Для исключения фоновых сигналов от хроматографической пластины обычно используется одновременное облучение на двух длинах волн. Оказывается возможным обеспечить измерения количественного состава разделенных веществ in situ * ). Чувствительность анализа в значительной мере определяется материалом подложки (алюминий, стекло, кремний) и составляет 3—100 нг. Такая методика полезна, например, для контроля качества пищевых продуктов, в частности для определения содержания синтетических красителей в кондитерских изделиях. Сочетание пространственного (по поверхности хроматографической пластинки) и спектрального (при использовании лазеров на красителях) сканирования позволяет осуществлять двумерный ОА анализ индивидуальных соединений при их неполном разделении [П. 41 — П. 43].
*В естественных условиях (лат.).
Интересно применение ОА метода для количественного определения концентрации глюкозы в растворе крови с помощью специальной многослойной окрашенной пленки толщиной 400 мкм. Диапазон измерений метода 0—2 г/л оказывается достаточным для быстрого и точного диагноза диабета [14].
Рис. 5.8. ОА спектр интактного зеленого листа [П. 44]
Изучение структуры листьев растений и эффективности фотосинтеза. Изучение структуры листьев растений является одним из наиболее наглядных применений ОА метода в биологических исследованиях. На ОА спектре зеленого листа (рис. 5.8) отчетливо видны все характеристические полосы поглощения хлоропластов, присутствующих в ткани листа: полоса Соре вблизи 420 нм, полоса поглощения каротиноидов в области 450— 550 нм и полоса, принадлежащая хлорофиллу, между 600 и 700 нм. В УФ диапазоне находится полоса поглощения воскообразного слоя листа. Применение фазового ОА метода и изменение частоты модуляции позволяют осуществлять зондирование листьев растений, определяя тем самым глубину залегания отдельных хромофоров [П. 46].
В интактных листьях под действием модулированного света происходит выделение кислорода, что изменяет характер регистрируемого сигнала. Дополнительная фоновая засветка интенсивным немодулированным белым или красным светом может привести к насыщению процессов фотосинтеза и также изменить ОА сигнал. Эти явления используются для определения квантового выхода выделения кислорода и запасенной фотохимической энергии, исследования фотосинтезирующих хроматических переходов и эффектов усиления Эмерсона (увеличения выделения 02 и тушения флуоресценции) в интактных листьях, выявления сложных переходных процессов, зависящих от режима освещения листа.
Например, определение квантового выхода выделения кислорода листьями фасоли с помощью ОА техники может служить в качестве экспресс-метода отбора генотипов фасоли по признаку их теплоустойчивости [22].
Процессы фотосинтеза исследуются ОА методом не только в листьях или выделенных из них хлоропластных препаратах, но и в водорослях. В частности, для зеленых водорослей Briopsis maxima обнаружено, что вклад кислорода, выделяющегося под действием модулированного света, в ОА сигнал незначителен. Это обусловлено структурой водорослей.
Метод ОА спектроскопии применяется также для анализа содержания свободного хлорофилла в листьях капусты, подвергнутых воздействию солей металла. Взаимодействие хлорофилла с ионами металлов контролируют по пику вблизи =685 нм, активность взаимодействия падает в ряду Си, Pb, Ni, Cd. С помощью ОА анализа листьев можно определять степень их токсикации металлами. С помощью излучения Кг лазера ( =647 нм) с псевдослучайной последовательностью импульсов удается изучать динамику воздействия гербицидов на хлоропласты листьев салата [П. 46].
В ферментативных реакциях окисления в живых клетках участвует сложное органическое соединение НАДН (восстановленный никотинамид-дениндинуклеотид). ОА спектроскопия НАДН является очень чувствительным методом как для обычных биохимических анализов, так и для исследования сложных процессов с участием НАДН (диапазон концентраций НАДН: 5-10-7—100-5 моль/л, источник света — импульсный азотный лазер, ОА ячейка с пьезоэлектрическим гидрофоном).
Можно использовать ОА метод для прогнозирования урожайности сельскохозяйственных культур. Спектры поглощения листьев для этого снимаются в диапазоне поглощения хлорофилла. Их можно использовать для поиска образца с наибольшей фотохимической активностью (меньший ОА сигнал) в наборе сходных образцов. Растение, которое имеет большую фотохимическую активность, в том числе и на ранних стадиях роста, способно дать больший урожай.
Исследование бактерий, клеток, микроорганизмов [П. 23, П. 44 — П. 46]. Метод ОА спектроскопии применяют для исследования сине-зеленых водорослей. Микробиологи относят их к бактериям и называют цианобактериями. В спектре водной суспензии сине-зеленых бактерий Synechococcus Sp проявляются полосы поглощения хлорофилла (Х«660 нм), фикоцианина ( =615 нм), полоса Соре (около =420 нм) и протеинов ( =280 нм). Объектом изучения были также осажденные на нитроцеллюлозные фильтры цианобактерии Anacystis nidulans. Сравнение фотосинтезирующей эффективности пигментов показывает, что она убывает в ряду: фикоцианин, хлорофилл, каротиноиды.
Имеется возможность обнаружения бактерий и определения различных состояний в их развитии. Так в спектре Bacillus subtilis наблюдается сильно поглощающая область около А,=410 нм, когда бактерии существуют в виде спор, и она отсутствует, когда бактерии находятся в вегетативном состоянии. В специальных клетках, выделенных из цианобактерий Anabaema 7120, ОА методом изучены: циклический транспорт электрона в фотосистеме I, фиксация азота и дыхание.
ОА метод позволяет изучать воздействие медикаментов на микроорганизмы, например действие антималярнйного препарата на лиофильные клетки малярийных паразитов. Метод не требует специальной подготовки таких образцов и позволяет проводить исследования in vivo. Еще одно успешное применение ОА спектроскопии — это исследование фотоцикла бактериородопсина. Материалом для изучения служат суспензии пурпурных мембран Halobacterium Halo- bium. Исследования возможны в широком интервале температур (90—300 К). С помощью частотной зависимости амплитуды ОА сигнала можно различать модели энергетики фотоцикла бактериородопсина.
Эти исследования с бактериородопсином можно проводить и методом температурного скачка, который заключается в быстром импульсном лазерном разогреве водных суспензий и растворов биообъектов и наблюдении кинетики фотохимических процессов [15]. Наилучшим образом для этих целей подходит излучение АИГ : Ег лазера с А,=2,94 мкм, попадающее в полосу поглощения воды (а« «104 см-1). Длительности импульсов лежат в пико- и наносекундном диапазонах, разогрев биообъекта составляет от нескольких до десятков градусов, толщина разогреваемого слоя от нескольких до десятков микрометров.
Исследование крови. Абсорбционно-трансмиссионная спектроскопия при исследовании крови не дает удовлетворительных результатов из-за светорассеяния, обусловленного наличием в плазме липидных материалов и красных кровяных клеток. Такие исследования возможны лишь при значительном усложнении методики измерений, учитывающей эффекты рассеяния. В ОА спектроскопии рассеяние света не играет решающей роли. Исследование цельной крови, в том числе и с добавлением токсических веществ, ОА методом позволяет изучать процесс осаждения и судить о химических реакциях в образцах [16]. В качестве источника света использовались Аг лазер (мощностью 30—300 мВт) или ксеноновая лампа (300 Вт). ОА ячейка имела сапфировое окно, через которое осуществлялось освещение и которое служило звукопроводом. На одной кромке этого окна монтировался пьезоэлектрический кристалл.
В ОА спектре крови легко регистрируются изменения, вызванные разной степенью насыщения ее кислородом |П. 44, 16]. С помощью ОА спектроскопии цельной крови и выделенных из нее эритроцитов показана возможность диагностики лейкемии и ряда сердечно-сосудистых заболеваний (рис. 5.9) [17].
В естественных условиях (лат.).
Анализ биотканей, определение влажности [П. 23, П. 41, П. 44 — П. 46]. Первые исследования в дерматологии ОА методом были выполнены в основном на вырезанных эпидермических образцах тканей человека и животных. В этих исследованиях была обнаружена полоса поглощения протеинов в области 280—290 нм, а также получена
Рис. 5.9. ОА спектры цельной крови здорового человека (/) и больных лейкемией (2, 3)
зависимость амплитуды ОА сигнала от содержания воды в образце. Интересны эксперименты по обнаружению медикаментов в тканях, изучению их действия на кожу, определению скорости их диффузии.
Удалось зафиксировать изменения гидратации тонкого рогового слоя (9—13 мкм). Изменения гидратации рогового слоя изменяют характер УФ поглощения пробы за счет изменения его тепловых свойств. Для определения влажности можно ограничиться только одной длиной волны например в максимуме поглощения (Х=280 нм), поскольку увеличение влажности приводит к снижению амплитуды ОА сигнала во всем спектре.
Другой подход к определению водного содержания в тканях связан с использованием спектра поглощения воды в ближней ИК области. Методика определения влажности твердых материалов апробирована на примере синтетического протеина, бумаги, порошка молочного суррогата. С помощью ОА спектрометра оказывается возможным определять наличие свободной воды, связанной или то и другое при измерении поглощения на &lsquo-к= 1,9- 2,2 или 1,4 мкм. Эта методика определения влажности отличается быстротой проведения анализа, нечувствительностью к изменениям в массе образца и в размерах частиц.
Главная трудность кожных ОА измерений in vivo — чувствительность микрофона к движениям тела (мускульная активность, ток крови, нервные импульсы). Для преодоления этих трудностей разработан спектрометр с дифференциальной ОА ячейкой с открытым концом для измерения in situ (рис. 5.6з). Свет на образец поступает по световоду, поэтому можно прикреплять ячейку к исследуемому образцу в любом удобном месте. Получены ОА спектры кожи брюшной полости крысы, кожи предплечья добровольца, обработанной мербромином. Эти эксперименты показали, что ОА сигналы могут быть зарегистрированы с удовлетворительным отношением сигнал/шум. Измерения глубины
Рис. 5.10. ОА спектры нормального (1) и пораженного катарактой (2) хрусталиков [П. 44]
проникновения светозащитных лекарственных препаратов в кожу человека in vivo и in situ можно осуществить с помощью резонансного спектрофона открытого типа (рис. 5.6а) путем изменения частоты модуляции света в широких пределах 0,18—1,2 кГц [П. 46].
ОА спектроскопия может быть особенно полезной в офтальмологии. С помощью ОА методики можно получить спектр поглощения хрусталика, не разрушая его (рис. 5.10). Максимум поглощения при =280 нм обусловлен поглощением тирозина и триптофана. Хрусталик, пораженный
катарактой, имеет более сильное поглощение не только в области 280 нм, но и в видимой и ИК областях спектра. Однако это поглощение не определяет прозрачность хрусталика, которая в видимой области зависит главным образом от светорассеивающих свойств хрусталика, пораженного катарактой (гл. 2).
Импульсная ОА спектроскопия с большим временным разрешением (порядка 4 не) на трех длинах волн (эксимерные лазеры: KrF (31=248 нм) и ХеС1 ( =308 нм), вторая гармоника АИГ : Nd лазера (А,=532 нм)) позволяют эффективно исследовать оптические, теплофизические и акустические свойства нормальной и перерожденной ткани аорты человека, определять порог разрушения ткани по энергии и временной экспозиции [1.26,9]. Эти исследования важны для реализации методов лазерной ангиопластики, а также выявления механизмов абляции биотканей под действием импульсного УФ излучения [23]. Так, в [23] на примере изучения тонких (порядка 30 мкм) срезов роговицы глаз кролика при облучении излучением ArF лазера (Л. = 193 нм) определена длительность процесса абляции (порядка 30 не). Малая длительность процесса указывает на то, что механизм абляции биоткани под действием импульсного УФ излучения имеет не тепловую, а фотохимическую природу.
Значительные возможности в изучении оптических и теплофизических параметров биотканей имеет метод импульсной оптико-термической радиометрии [18, 21]. Этот метод также оказался достаточно эффективным при измерениях коэффициентов поглощения здоровой и патологической ткани артериальной стенки и атеросклеротических бляшек [21]. Частично данные [21] представлены в табл. 1.1. При возбуждении таких биотканей, как дентина зуба, срезы картофеля и кожи пальца человека, излучением АИГ : Ег лазера ( =2,94 мкм) и регистрации их теплового излучения в диапазоне 4—9 мкм оказывается возможным определять коэффициенты поглощения света на длине волны лазера и в спектральном диапазоне излучения ткани, а также температуропроводность и объемную теплоемкость указанных тканей [18].
Фотоакустическая микроскопия и визуализация. Основные принципы фотоакустической микроскопии (ФАМ) достаточно просты [П. 41]. Сканирование сфокусированного лазерного пучка по поверхности объекта и регистрация с помощью микрофона или пьезодатчика акустического сигнала позволяют получать локальную информацию
об оптических, тепловых и акустических свойствах биообъекта. Так как амплитуда ОА сигнала зависит от интенсивности поглощенного света, то ФАМ должна давать информацию не только о характере поглощения света веществом, но и о локальной структуре, качестве поверхности и других параметрах объекта, получаемых с помощью обычной оптической микроскопии. Одновременное сканирование длины волны излучения позволяет получать локальные спектры поглощения. Поскольку амплитуда ОА сигнала связана обратной зависимостью с интенсивностью люминесценции исследуемого вещества, то существует возможность построения аналога люминесцентного микроскопа, а также возможность изучения локализованных в пространстве фотовольтаического и фотохимического процессов.
С помощью ФАМ можно обеспечить сканирование объекта по его глубине. Изменяя длину волны лазера, можно регулировать глубину проникновения света в вещество и возбуждать ОА сигнал на разных глубинах. Другой путь — изменение частоты модуляции лазерного пучка. Это свойство является уникальным и выделяем ФАМ из других способов микроскопии. Глубина зондирования определяется термодиффузионной длиной для данной частоты модуляции. Например, для непрозрачного образца (а=10+6 см-1) ОА сигнал можно возбудить на глубинах от 0,1 до 10® мкм, если изменить частоту модуляции от 100 МГц до 1 Гц.
Технические решения в области применения ФАМ проанализированы в [П. 41]. Достигнутая разрешающая способность ФАМ в видимой области спектра не превышает 7—15 мкм. Однако по информативности ФАМ существенно превосходит оптическую микроскопию, поскольку позволяет визуализировать детали микроструктуры непрозрачных для света объектов, тем самым дополняет и расширяет традиционные методы микроспектрального анализа и имеет перспективы применения в биологии и медицине.
Например, эффекты возбуждения акустических волн мощным лазерным импульсом короткой длительности можно использовать для диагностики катаракты, а также внутриглазных новообразований (П. 14, 20]. Промышленный лазерный фотоакустический микроскоп типа ФМ-ЗМ, предназначенный для изучения широкого класса биообъектов и биотканей (визуализации структурных дефектов и особенностей строения), описан в [20]. Данные по визуализации и определению теплофизических параметров тонких срезов (порядка 5 мкм) некоторых биотканей (ткани глаза и почек животных), полученные фазовым методом при облучении обратной поверхности объекта, представлены в [24].
