Применение спектроскопии кр в офтальмологии - лазерная диагностика в биологии и медицине
Применение спектроскопии КР в офтальмологии
В последнее время спектроскопия КР как неразрушающий неинвазивный метод лазерной диагностики, дающий информацию об объекте на молекулярном уровне и имеющий значительные перспективы для проведения анализа in vivo и in situ, все больше проникает в область медицинских исследований. Первым и остающимся одним из основных применений спектроскопии КР в медицине является офтальмология, а именно изучение интактных хрусталиков животных и человека [34—40].
Рис. 6.9. Блок-схема спектрометра для измерений in vivo [38]: 1 — лазер на красителях, 2 — эксимерный лазер, 3 — непрерывный Аг лазер ( =488 нм), 4 — образец, 5 — дифракционный спектрограф, 6 — синхронный импульсный генератор, 7 — охлаждаемый многоканальный детектор, 8— графопостроитель, 9—ЭВМ, 10 — дисплей, 11 — магнитная память. Штриховыми линиями показана часть установки для импульсной КР-диагностики, которая пока не реализована
Разработка КР-микроспектрометров с многоканальной регистрацией спектров, обеспечивающих высокое быстродействие и пространственное разрешение (локальность) при значительной чувствительности, открывает возможность проведения ранней диагностики такого серьезного и массового заболевания, как катаракта [35, 37, 39, 40].
Блок-схема одного из таких спектрометров представлена на рис. 6.9. Главным элементом спектрометра является высокочувствительный охлаждаемый многоканальный детектор, который в сочетании с Аг лазером (А.=488 нм) небольшой мощности (2—30 мВт) позволяет получать КР-
спектры в довольно широкой полосе частот за очень малое время (0,5 с). Эти обстоятельства определяют возможность снятия КР-спектров in vivo, что и демонстрируют изображенные на рис. 6.10 КР-спектры хрусталика глаза кролика
Рис. 6.10. КР-спектры хрусталика глаза кролика в области ядра [39]: 1 — измерения in vivo, мощность излучения лазера Р=2 мВт- 2 — измерения на изолированном хрусталике (Р=30 мВт). Время экспозиции для каждого из трех фрагментов спектра порядка 0,5 с
в области ядра [39]. Заметим, что мощность излучения лазера 2 мВт при времени облучения 0,5 с является предельной, при которой не происходит повреждения сетчатки глаза.
Дальнейшие усовершенствования спектрометра в плане возбуждения импульсных КР-спектров с помощью перестраиваемого лазера на красителях, накачиваемого экси- мерным дазером, должно позволить с еще большей гарантией реализовать измерения in vivo за счет оптимизации возбуждениячспектров (подстройка частоты лазера) и уменьшения экспозиции (импульсный режим).
Микроспектрометр КР на базе аргонового лазера (А,= =514,5 нм) с мощностью 60 мВт и диаметром пятна на объекте 2 мкм описан в [37].
Таблица 6.1
Характерные полосы спектра КР свежеприготовленного целого хрусталика глаза кролика, полученного от поверхностного слоя под ядром хрусталика.
Значения КР-сдвигов частоты приведены без учета нелинейности шкалы длин волн спектрографа (фенилаланин — Ф, тирозин — TP3, триптофан — ТРФ) [37]
КР-сдвиг частоты, см&rdquo-1 | Отнесение | КР-сдвиг частоты, см-1 | Отнесение частоты |
622 | Ф | 1256 | Амид-3 |
644 | ТРЗ | 1268 | Амид-3 |
697 | С—S-колеб. | 1322 | С— Н-колеб. |
725 | С—S-колеб. | 1342 | ТРФ |
760 | ТРФ | 1404 | —С02-колеб. |
829 | ТРЗ | 1450 | СН2-колеб. |
855 | ТРЗ | 1550 | ТРФ |
880 | ТРФ | 1586 | ТРЗ, Ф |
936 | С-С-колеб. | 1606 | Ф |
961 | С—С-колеб. | 1617 | ТРЗ |
1005 | Ф | 1670 | Амид-1 |
1032 | Ф | 2568 | S—Н-колеб. |
1075 | С—N-колеб. | 2877 | С—Н (неароматич.) |
1129 | С—N-колеб. | 2939 | С—Н (неароматич.) |
1159 | С—N-колеб. | 3062 | С—Н (ароматич.) |
1177 | ТРЗ, Ф | 3287 | Н20, N —Н-колеб. |
1209 | ТРЗ | 3390 | Н20 |
1240 | Амид-3 |
Спектры хрусталика снимались в диапазонах 200—1400, 700—1900, 2400—3600 и 2800— 4000 см-1 с помощью дифракционного спектрометра и многоканального анализатора с линейкой из 1024 фотодиодов. Время измерения полного спектра составляло 5—30 мин. Данные по КР-сдвигам частоты характерных полос в спектре и результаты их отнесения, приведенные авторами [37], представлены в табл. 6.1.
КР-спектр нормального хрусталика образуется перекрывающимися спектрами так называемых а-, бета- и у-кристаллинов — структурных протеинов, общий вес которых в хрусталике млекопитающих составляет приблизительно S3 % от общего веса хрусталика, спектрами их/производных (в основном агрегатов протеинов) и воды, содержащейся в хрусталике [34]. С помощью спектроскопии КР изучается молекулярная структура нормальных, состарившихся и катарактальных хрусталиков животных и человека, в том числе и хрусталиков, подвергнутых воздействию лекарственных препаратов [34—40]. Наиболее интересные результаты получены для вторичной структуры протеинов хрусталика и для микроокружения боковых групп протеинов, таких как триптофан, тирозин и сульфидные группы. <2 точки зрения ранней диагностики катаракты представляют интерес следующие полосы [38, 39]: полоса в диапазоне 3600—3100 см-1, определяемая наличием воды в хрусталике- полоса с частотой 2580 см-1 (2568 см-1 по данным [37], табл. 6.1), отнесенная к валентным колебаниям сульфидных групп дистеинового остатка- дублетные полосы тирозина на 855 и 831 см-1- конформационные полосы поли- пептидного основания на 1672 см-1 амида-1 и 1240 см-1 амида-3- полосы триптофана на 644 см-1 и фенилаланина на 624 см-1 (622 см-1 [37], табл. 6.1).
Отношение интенсивности полосы 3390 см-1 (ОН-валентные колебания) к интенсивности полосы 2935 см-1 (СН-валентные колебания) изменяется от 0,40 для прозрачного хрусталика до 0,50 для катарактального хрусталика глаза кролика (табл. 6.2). При обработке хрусталика антикатарактальным лекарственным препаратом это соотношение устанавливается на уровне 0,43. Обратные процессы происходят в ядре хрусталика глаза мыши при старении, когда это отношение уменьшается от 0,33 до 0,18 [34]. Эти • изменения свидетельствуют о потере воды в процессе старения. В то же время исследование трех типов катаракт у мышей показывает, что интенсивность ОН-валентных колебаний (3390 см-1) существенно возрастает по мере помутнения хрусталика. Например, отношение интенсивностей для катарактального и нормального хрусталиков при одинаковом возрасте, равном 4 месяцам, составляет 1,1—1,4.
Таким образом, относительная интенсивность характеристических колебаний Н20 может служить в качестве теста при диагностике катаракты. Однако необходимы соответствующие исследования на хрусталиках человека.
Отношения интенсивностей наиболее характерных КР- полос хрусталика глаза кролика, чувствительных к ис- 194 искусственно вызванной за счет соответствующей диеты катаракте, представлены в табл. 6.2 [38]. Эти изменения в полосах, соответствующих воде, сульфидным группам, тирозину, триптофану и фенилаланину, а также амиду-1 и амиду-3, предполагают ряд структурных модификаций, возникающих при формировании катаракты, которые приводят к частичному преобразованию триптофановых остатков протеинов хрусталика из «закрытой» в «открытую» форму, возможности вовлечения тирозиновых остатков в предполагаемый процесс «агрегации протеинов», одновременному частичному превращению SH-групп цистеина в S—S связи.
Таблица 6.2
Отношение интенсивностей КР-полос хрусталика глаза кролика
Катаракта вызвана искусственно за счет диеты. Лекарственный препарат — Dondalina [38]
Отношение частот КР-полос | Отношение интенсивностей КР-полос | ||
Нормальный | Катарактальный хрусталик | ||
без лекарственных препаратов | с лекарственными препаратами | ||
3390/2935 | 0,40 | 0,50 | 0,43 |
2580/2730 | 1,53 | 1,38 | 1,43 |
831/855 | 0,92 | 0,96 | 0,94 |
880/760 | 0,78 | 0,66 | 0,71 |
644/624 | 1,77 | 1,44 | 1,55 |
При исследовании структурных изменений катарактальных хрусталиков человека возникают определенные трудности из-за их сильной флуоресценции, которая усиливается с возрастом. Отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности отдельных полос в КР-спектре является мерой патологии хрусталика, что связано с его помутнением за счет флуорофоров (высокомолекулярных агрегатов протеинов) [34—40]. Воздействие антикатарактальных препаратов значительно снижает фон флуоресценции в КР-спектрах. Этот эффект может служить мерой действия препаратов [38]. С другой стороны, увеличение длины волны возбуждающего лазера от 406,7 нм до 514,5 нм и далее До 647,1 нм позволяет сильно уменьшить фон флуоресценции и надежно регистрировать КР спектры [34].
С помощью разработанного в [37] многоканального микроспектрометра оказалось возможным получать КР-спектры микрообъемов хрусталиков глаз кролика и человека, соизмеримых с размерами локальных помутнения в катарактальном хрусталике, которые были определены с помощью электронной микроскопии. В прозрачном хрусталике были замечены изменения КР-спектров протеинов при сканировании сфокусированного лазерного пучка от центра к периферии хрусталика. Однако не было замечено изменений в спектрах двух соседних участков хрусталика — прозрачного и замутненного. Это может быть связано с трудностями настройки перетяжки сфокусированного пучка света на замутненное микровключение или, действительно, с очень малыми изменениями КР-спектров соседних участков. Замутнение хрусталика в этом случае может быть связано с флуктуациями дальнодействующего порядка ориентации протеинов, вызванного очень малыми изменениями пептидных цепей, и может быть исследовано с помощью поляризационной спектроскопии КР [37] и спектроскопии упругого светорассеяния (гл. 2).
Определенную надежду на решение в ближайшее время проблемы ранней диагностики катаракты методом спектроскопии КР вселяют успешно проведенные in vivo измерения КР-спектров хрусталика глаза кролика в области ядра (см. рис. 6.10). Это оказалось возможным благодаря развитию техники спектроскопии КР с применением многоканальных оптических анализаторов, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать широкую полосу КР- спектра за время порядка 0,5 с [36,38,39]. В [39] использован многоканальный детектор типа Tracor TN-6500, а в [37] — EG & GPA ОМА 111 с линейной из 1024 диодов, позволяющий снимать КР-спектры за несколько минут. Фирма Жобен Ивон (Франция) выпускает универсальные полностью автоматизированные микроспектрометры КР типа V1000 и S3000, оснащенные многоканальными оптическими детекторами.
