Микроскопия и микроспектрофлуориметрия - лазерная диагностика в биологии и медицине
Видео: Электронная микроскопия биологических объектов © Electron microscopy of biological objects
7.2. Лазерная флуоресцентная микроскопия
и микроспектрофлуориметрия
Общие сведения. Применение лазеров и цифровых методов обработки информации существенно продвинуло возможности микрофлуориметрической диагностики. С одной стороны, лазеры обеспечивают высокую спектральную плотность мощности возбуждающего излучения, которое с малыми потерями может быть сфокусировано в пятно диаметром около одного микрометра. С другой стороны, использование наряду с другими устройствами сопряженных с ЭВМ современных видеодетекторов, регистрирующих ультранизкие интенсивности, позволяет достичь сверхчувствительной регистрации пространственного распределения флуорофоров в клетках, мембранах, а также эффективно решать другие задачи, связанные с измерением малых количеств исследуемых веществ в различных модельных средах и биологических структурах.
Количественный микроспектрофлуориметрический анализ биологически активных молекул. Схема достаточно простого лазерного флуоресцентного микроскопа, построенного на базе люминесцентного микроскопа «Люмам-ИЗ», изображена на рис. 7.2 [9]. Для возбуждения флуоресценции используется непрерывный Не—Cd лазер (Ях=441,6 нм, >.г=325 нм).
Рис. 7.2. Схема импульсного флуоресцентного микроскопа: 1 — лазер, 2 — модулятор, 3> 10 — ФЭУ, 4 — телескоп, 5 — полевая диафрагма, 6 — селективное зеркало, 7 — объектив, 8 — исследуемый объект, 9 — светофильтр, 10 — усилители-дискриминаторы,
11 — блок сопряжения с ЭВМ, 12 — ЭВМ «Искра-226», 14 — монокулярная насадка [9]
Регистрация флуоресценции проводится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в режиме счета фотонов на одноэлектронном уровне с автоматическим вычитанием окружающего фона и собственных шумов ФЭУ. Диапазон длин волн — 360 — 800 нм, динамический диапазон измеряемых световых потоков — 10s, погрешность измерения минимально регистрируемого потока—10%, диаметр пучка возбуждающего излучения в области зондирования 1 — 100 мкм.
Микрофлуориметр использовался для количественного аминокислотного анализа и для определения содержания ДНК в клетках бактерий. В частности, при сканировании хроматографических пятен, полученных при разделении ДНС-производных аминокислот ДНС-Phe, ДНС-Gly и ДНС-Jle на пластинках с полиакридным покрытием, удалось достоверно зарегистрировать количества вещества в хроматографическом пятне 5-10-14 моль. Это на 1,5 порядка лучше достигнутых в настоящее время результатов по количественному детектированию производных аминокислот, разделенных методом тонкослойной хроматографии, полученных при возбуждении флуоресценции излучением ксеноновой лампы.
Одной из важнейших задач современной клеточной биологии является определение концентрации ионов свободного кальция [Са2*] внутри живых клеток. Эта задача успешно решается с помощью лазерных микрофлуориметров с применением флуоресцентных зондов. Для примера рассмотрим методику измерения [Са2+] в изолированных мышечных клетках [10]. В качестве зонда использовался краситель индо-1 с максимумом поглощения в комплексе с Са2+ на 331 нм, максимумом флуоресценции на 398 нм и квантовой эффективностью флуоресценции 0,56. Флуоресценция возбуждалась излучением Не—Cd лазера (X— =325 нм) с мощностью зондирующего пучка менее 1 мкВт.
Процедура измерения состоит в определении отношения интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн =422 и Я2=468 нм: /?=/(Х1)//(А.2) и дальнейшего вычисления но формуле [Са2+]=С6Д (Rmin—R)/(R—Rmax), где Rmin и Rmax — эт0 значения R при нулевой и насыщающей концентрациях Са2+ соответственно, С=0,972— константа пропорциональности, &д=250 нмоль/л — константа диссоциации. Значения Rmm, #max и R определялись на калиброванном 6 мкмоль растворе красителя.
Использование такой установки впервые позволило определять характерные значения [Са2+] в диапазоне 100 — 300 нмоль/л в живых клетках с точностью не хуже ±10 нмоль/л с пространственным разрешением 2 мкм за время менее 0,5 с.
Одним из направлений практического применения лазерной микроспектрофлуориметрии является идентификация и изучение свойств пигментов и красителей внутри живых клеток. Примером таких работ являются эксперименты по изучению фотоповедения одноклеточных водорослей, в которых с помощью этого метода были определены органелла, выполняющая роль фоторецептора, и молекула фотопигмента [П. 7].
Другой пример — регистрация в живых клетках спектров флуоресценции фотосенсибилизирующих красителей типа гематопорфирина, широкое использование которых в медицине начинается в связи с разработкой эффективных методов лазерной диагностики и терапии злокачественных опухолей. Более подробно этот пример будет рассмотрен в 7.3. jOI ]
Общим для этих работ является использование импульсных перестраиваемых лазеров и проведение кинетических измерений с высоким временным разрешением.
Инструментальная база современной флуоресцентной микроскопии кроме лазеров и ФЭУ в режиме счета фотонов включает видеодетекторы, работающие при очень низких уровнях интенсивности флуоресценции с дискретизацией видеокадров, их последующим вводом в ЭВМ и цифровой обработкой. Видеомикрофлуориметры обладают рядом особенностей, важных для проведения биомедицинских исследований: быстрой обработкой информации, крайне чувствительным детектированием, цифровым форматированием и анализом данных, сохранением и накоплением информации о пространственных соотношениях. Эти особенности позволяют проводить регистрацию пространственно-временных распределений флуоресцирующих компонентов в исследуемом объекте со скоростью и точностью, ранее недостижимой другими методами. Хранение видеоизображений на магнитных дисках не только обеспечивает 100 % -ную надежность их повторного использования, но и позволяет исследователю многократно обращаться к ним с целью математической обработки по различным алгоритмам.
Микрофлуоресцентный анализ внутриклеточного транспорта. Цифровое представление изображений флуоресцирующего объекта особенно важно при исследовании распределения молекул на клеточных мембранах, движения внутриклеточных частиц, компартментализации специфических зондов внутри клетки, а также клеточной подвижности.
Например, в настоящее время ведутся работы по изучению взаимодействия гормонов и факторов роста с мембранными рецепторами клетки и их последующей интернализации. Одной из целей этой работы является выяснения механизмов нарушения регуляции роста в раковых клетках. Большинство макромолекулярных лигандов связывается с клеткой в процессе эндоцитоза через посредство рецепторов. Комплексы лиганд — рецептор обволакиваются общей мембраной, образованной из отдельных участков плазматической мембраны клетки. Образовавшиеся закрытые везикулы транспортируются внутрь клетки по определенным адресам, например к ядру. Этот-то транспорт в живых клетках и удается визуализировать с помощью флуоресцирующих антител, присоединяемых к везикулам. Процедуры цифрового усреднения изображений позволяют изучать характер движения закрытых везикул при таких низких уровнях возбуждения, при которых визуально в микроскоп флуоресцирующие везикулы просто неотличимы от фона.
В качестве другой важной задачи можно назвать измерение трансляционной диффузии в плоскости мембран и в сравнительно тонких объемных объектах. Эта задача решается с помощью методов фотообесцвечивания. В основе этих методов лежит фотообесцвечивание локальных областей исследуемого объекта, несущих флуоресцентные молекулы, с целью нарушения их флуоресценции и последующего измерения кинетики восстановления флуоресценции вследствие диффузного притока необесцвеченных флуорофоров из окружающей среды в засвеченную лазерным пучком область. Эта область может иметь вид пятна, полоски или другую форму.
Кинетика восстановления флуоресценции связана с коэффициентом диффузии или скоростью потока меченых молекул [II]. Например, в случае восстановления флуоресценции в двухмерном диффузионно ограниченном объекте коэффициент диффузии прямо пропорционален квадрату радиуса лазерного пятна в плоскости объекта и обратно пропорционален времени восстановления флуоресценции до половины исходного уровня. Конечный уровень, до которого восстанавливается флуоресценция, связан с подвижной фракцией меченых молекул.
В настоящее время никакой другой метод не дает сравнимой информации о трансляционной подвижности молекул в определенных областях мембран единичных клеток или клеточных органоидов. Основными этапами эксперимента являются:
регистрация флуоресценции из заранее выделенной области мембраны, поверхности или тонкой пленки объекта размером в несколько микрометров-
импульсное облучение этой области пучком лазера (как правило, Не—Cd или Аг), быстро разрушающим большую часть флуорофоров за время 5—50 мкс, вследствие чего интенсивность флуоресценции из этой области резко падает-
измерение кинетики восстановления флуоресценции, начиная с момента окончания обесцвечивающего импульса, для чего на исследуемую область направляется маломощный «измерительный» пучок лазерного излучения (обычно в 103—105 раз более слабый), возбуждающий флуоресценцию так же, как и на первом этапе.
При проведении подобных экспериментов регистрация флуоресценции может осуществляться с помощью ФЭУ. Однако применение видеосистем может дать возможность изучения пространственных деталей процесса восстановления, что позволяет в принципе рассчитывать локальные значения коэффициентов диффузии или скорости потока в исследуемой области, например внутри клетки.
Метод измерения кинетики восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания используется для исследования процессов агрегирования макромолекул и самосборки клеточных органоидов. Например, этим методом были изучены направление и механизм полимеризации микротрубочек. В качестве флуорофора использовался флуоресцеин. Измерения позволили исключить гипотезу, в соответствии с которой мономеры тубулина включаются в микротрубочку в средней части и теряются на концевых участка х.
Исследовалась кинетика полимеризации глобулярного актина в водном растворе в присутствии соли КС1 или дивалентных катионов Са2+ и Mg2+. В процессе полимеризации образуются длинные (10 — 100 мкм) филаменты F- актина. Было впервые доказано, что остающаяся неполимеризованной фракция актина в присутствии растущих филаментов представляет собой мономерную форму G-актина.
Данная методика позволяет точно проследить влияние различных реагентов на процесс самосборки. Например, добавление цитохалазина Б приводит к укорачиванию филаментов, а добавление в раствор алдолазы — белка, связывающегося с актиновыми филаментами,— приводит к увеличению слабо подвижной фракции актина. Вероятнее всего, это происходит из-за образования алдолазных сшивок между нитями F-актина.
Наиболее интересными представляются опыты с живыми амебами. Путем микроинъекций в клетку впрыскивались меченые флуоресцеином белки: G-актин, бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбумин и рибонуклеаза А. Измеренные значения коэффициентов диффузии этих белковых молекул в клетке оказались в 2—3 раза ниже, чем в воде. Более того, оказалось, что молекулы G-актина, хотя их молекулярный вес на 50 % меньше, чем у молекул БСА, диффундируют медленнее, чем молекулы БСА. Это подтверждает выдвигавшиеся ранее предположения о том, что в клетке G-актин находится в комплексе с другими молекулами значительного размера типа профилина.
Кроме того, наблюдение кинетики восстановления флуоресценции после обесцвечивания показало, что неподвижная фракция F-актина составляет в среднем около 10 % от общего содержания актина в клетке. В разных частях клетки это соотношение разное: в хвостовой части — больше, в более подвижной головной части — меньше. В области плазмалеммы содержится до 50—80 % малоподвижных филаментов. Эти и другие исследования (например, по самосборке микротрубочек) показывают, что метод фотообесцвечивания является очень эффективным не только при измерении подвижности мембран, но и при изучении транспорта макромолекул в растворах и во внутриклеточном матриксе.
