Заключение - лазерная диагностика в биологии и медицине
Видео: "Современные принципы диагностики и лечения сарком мягких тканей" (часть 2)
Видео: Биохимия организма
При написании данной книги авторы ставили перед собой задачу познакомить широкого читателя с новой бурно развивающейся и увлекательной областью исследований, заключающейся в разработке методов лазерной диагностики применительно к задачам, решаемым в биологии и медицине. В книге представлены самые разнообразные методы диагностики. Некоторые из этих методов уже хорошо себя зарекомендовали при использовании в клиниках и лабораториях, налажен промышленный выпуск соответствующей диагностической аппаратуры. Другие методы находятся в стадии разработки и с их помощью получены лишь самые первые результаты.
На сегодняшний день ситуация такова, что практически каждый новый метод или методика лазерной макро- или микродиагностики апробируются на исследовании биообъектов, и нет возможности даже перечислить все эти методы. Поэтому ряд методов и конкретных примеров их применения в биологии и медицине остался вне поля зрения авторов. Однако нельзя не сказать хотя бы в заключении о целом большом классе лазерных методов диагностики, который вообще не затрагивался в книге,— это методы разрушающей диагностики.
Из-за сложности биообъектов с помощью неразрушающих методов микродиагностики зачастую удается получить лишь качественную информацию о составе вещества, наличии примесей и пр. В связи с этим интенсивно развиваются методы лазерной аналитической спектроскопии, основанные на эффектах лазерного фотовозбуждения и фотоионизации предварительно подготовленных проб биообъектов путем локального испарения или распыления лазерным, электронным или ионным пучками, их атомизации в пламени, термической атомизации в вакууме или инертном газе. Эти методы обладают высокой чувствительностью и позволяют получить количественную информацию о содержании различных, например токсических, примесей в биообъектах [П. 40, П. 42, П. 47, 1].
Условно лазерные методы разрушающей диагностики можно разделить на две группы.
К первой группе относятся методы лазерно-ионизационной спектроскопии, в которых, как правило, не требуется обеспечение локальности диагностики. В этих методах биообъект предварительно тем или иным способом атомизируется или обеспечивается десорбция молекул с его поверхности. После подготовки образца, применяя различные методы однофотонной или многофотонной ионизации лазерным излучением, получают поток ионов (М+, е~, (М+С)+) (рис. 5.1), который анализируют путем измерения электропроводности плазмы, или регистрации вторичных электронов, или использования пропорциональных счетчиков ионов, или спектрометрии подвижности ионов, или масс- спектрометрии образовавшихся ионов.
Ко второй группе относятся методы лазерного микро- спектрального анализа, которые, как правило, обеспечивают высокое пространственное разрешение анализа за счет локального испарения чрезвычайно малых объемов биообъекта (микропроб) сфокусированным лазерным пучком. Далее используют традиционные методы анализа испаренного вещества: эмиссионную спектроскопию (при дополнительном возбуждении плазмы в дуговом разряде), абсорбционно-трансмиссионную спектроскопию или флуоресцентную спектроскопию, а также масс-спектрометрию.
Современные задачи диагностики (токсикология, загрязнение окружающей среды) требуют развития методов, позволяющих контролировать содержание примесей в веществ в пределах 10-8—10_и %. Такая чувствительность реализуется в схемах ступенчатой лазерной фотоионизации при атомизации за счет нагрева вещества в тиглях (до 3000 °С) в атмосфере инертных газов или в вакууме, нагрева, испарения и распыления вещества мощными лазерными, электронными или ионными пучками [П. 42, 1].
Термическая атомизация в вакууме является наиболее универсальным и достаточно простым методом, позволяющим обеспечить чувствительность, близкую к предельной. Он применим для широкого класса веществ, в том числе и биологического происхождения. Для его реализации достаточно иметь вакуум в рабочей камере на уровне 10-6 Торр.
Для осуществления многофотонной ступенчатой ионизации атомно-молекулярных пучков в наибольшей степени подходят лазеры на красителях с накачкой от эксимерных лазеров, которые излучают в диапазоне 217—970 нм. В эту область длин волн попадают атомные переходы большинства элементов периодической таблицы (80 %). Более простые системы могут использовать в качестве накачки азотный или медный лазеры.
Фотоионизационный метод наиболее интересен для исследования биологических объектов, поскольку дает возможность анализировать следовые концентрации примесей определенного элемента без предварительного разделения пробы. Известными примерами такой диагностики являются анализ следов А1 в крови и в морской воде, а также следов Ru в морской воде, в породах дна океана и костях рыб [П. 42, 1]. При использовании двух- и трехступенчатой схем возбуждения ридберговских состояний пределы обнаружения составили (1—2) *10-7 ат. % А1 и 3 «10-12 ат. % Ru.
Значительное место среди разрушающих методов диагностики занимает лазерная масс-спектрометрия [П. 42, П. 47]. Использование лазерной фотоионизации обеспечивает повышенную селективность анализа, высокий выход ионов (до 100 %) и возможность исследования коротко- живущих продуктов. Масс-спектр представляет собой распределение массовых пиков по интенсивности и является характеристикой исследуемого биообъекта. В лазерной масс-спектрометрии наиболее широкое применение нашли времяпролетные системы с селекцией ионов в секторных электрических или магнитных полях, статические системы с двойной фокусировкой и динамические масс-спектрометры типа «масс-рефлектон».
Лазерная масс-спектрометрия используется для детектирования атомарных и молекулярных кластеров, примесных молекул и радикалов в газах, с ее помощью исследуются различные соединения, важные для биологии, медицины, фармакологии. Например, близкая к 100 % эффективность двухступенчатой фотоиснизации молекул нафталина излучением KrF лазера (Х=248 нм) позволяет детектировать одиночные молекулы в объеме облучения за один лазерный импульс. В результате чувствительность анализа соответствует регистрации молекул нафталина при их парциальном давлении на уровне 10-14Торр или относительной концентрации в воздухе 10-8 [П. 42].
Достоинства лазерной мэсс-спектрометрии проявляются при изучении труднолетучих и неустойчивых к нагреванию органических и биоорганических молекул, которые трудно перевести в газовую фазу. Масс-спектры молекулярных кристаллов аденина, антрацена, гуанина, тимина, урацила, цитозина и трипептида представлены в [П. 42]. Там же даны результаты обширных исследований по масс-спектрометрии, выполненных для различных классов органических биологически активных нелетучих соединений: олигосахаридов, гликозидов, нуклеотидов, аминокислот и олигопептидов и др. Для уверенной записи масс-спектра достаточно, например, образца сахарозы массой 5 нг.
Эмиссионный спектр излучения плазмы исследуется разными способами в зависимости от решаемых задач. Например, выпускаемый промышленностью ГДР прибор LMA-10 использует дифракционный спектрограф с фотографической регистрацией спектра [2]. Этот прибор обеспечивает минимальные размеры проб 10x10 мкм при аналитической чувствительности 10-11—10-13 г. В качестве лазерного источника применяется рубиновый лазер с модуляцией добротности.
Совмещение лазерного испарения вещества с последующим абсорбционно-трансмиссионным анализом этих паров позволяет сочетать достоинства обоих методов, т. е. получать высокую степень локальности и значительную чувствительность. Такой спектрометр был использован при исследованиях распределения содержания Cd в корковом веществе почки человека [П. 40, 3]. При измерениях диаметр лазерного кратера в образце толщиной 4 мкм составлял 50 мкм, чувствительность детектирования достаточная при анализе меньше 0,1 пг вещества, погрешности измерений содержания Cd порядка 6—30 ррш.
Получил развитие метод лазерной микроаналитической масс-спектрометрии, или JTAMMA-метод, обеспечивающий разрешение на микронном или субмикронном уровнях [П. 42, П. 47]. Этот метод и соответствующая аппаратура разрабатывались специально для элементного анализа в биообъектах. JlAMMA-метод позволяет исследовать содержание любого элемента периодической таблицы в биологических веществах. Он не требует эталонов и позволяет проводить одновременный анализ многих элементов. Объекты исследования самые разнообразные: лекарственные препараты, сухая цельная кровь и ее компоненты (сыворотка, плазма, эритроциты), сетчатка глаза, ткани печени, ткани мышц и другие ткани органов животных, почечные камни, кормовые дрожжи, ткани растений (листья, корни, ветви и пр.) и др. [П. 42, П. 47, 4—8].
Пространственное разрешение метода достигает 1— 0,5 мкм, абсолютный предел обнаружения многих элементов 10-1-6 г, а концентрационный предел обнаружения 10-4— 10-8%. Расход количества вещества при анализе составляет всего 1 пг и даже меньше. Метод позволяет проводить анализ на клеточном и субклеточном уровнях разрешения, на единичных бактериях и частичках пыли.
Кроме элементного анализа ЛАММА-метод оказался полезным при изучении масс-спектров многих классов органических и биоорганических соединений: углеводов (олигосахаридов, гликозидов и др.), органических кислот (аскорбиновой, барбиталовой и др.), аминокислот и микропептидов (глицина, эланина, валина, лейцина, изолейцина, тирозина и фенилаланина), органических солей, ароматических соединений (антрацена, фенантрена, дибензогиофена, ди-бензофурана, карбазола, трифенила фосфора), металлоорганических комплексов, соединений с большим молекулярным весом (кобаламинов, гликозидадигитонина и синтетического липида при добавлении в образец хлоридов натрия, калия и цезия) [П. 42].
ЛАММА-метод реализован в разнообразных промышленных лазерных масс-спектрометрах чипа LAMMA-1000 (ФРГ), LIMA (Англия), ЭМАЛ, ЭМАЛ-2 (СССР) [П. 42, П. 47].
