Лазерный флуоресцентный анализ - лазерная диагностика в биологии и медицине
Видео: 11-12 октября 2011
Видео: Лазерное удаление опухоли спинного мозга в Израиле
Глава 7
ЛАЗЕРНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Хорошо известны большие возможности, которые открыло в медико-биологических исследованиях применение люминесцентного анализа [1—5]. Благодаря высокой чувствительности к малым количествам биологического материала и хорошей воспроизводимости результатов, этот метод стал использоваться для решения широкого круга задач в области молекулярной и клеточной биологии, вирусологии, биофизики мембран. В медицине люминесценция используется для диагностики важнейших физиологических процессов, для контроля за поступлением, превращением и выводом из организма лекарств, для диагностики большого числа заболеваний от гриппа до рака, для контроля качества пищевых продуктов и чистоты окружающей среды и т. д.
В этой главе показано, что применение лазерной техники в одних случаях придает люминесцентному анализу качественно новые возможности, в других — использование лазеров позволяет существенно повысить эффективность исследований.
После краткого описания физических основ лазерного люминесцентного анализа рассмотрены разработанные к настоящему времени технические средства, позволяющие, в частности, проводить кинетические измерения с большим пространственным и временным разрешением и с цифровой обработкой информации. Возможности метода продемонстрированы на ряде примеров от изучения свойств макромолекул, отдельных живых клеток и микроорганизмов до диагностики злокачественных опухолей и атеросклеротических изменений сосудов.
В заключительной части приведены примеры дистанционной флуоресцентной диагностики фотосинтезирующих биологических объектов с борта самолета или судна.
Общие сведения. В основе лазерного флуоресцентного анализа лежит регистрация фотонов, испускаемых молекулами при переходе из электронно-возбужденного в основное состояние (см. рис. 5.1, 7.1). На рис. 7.1 основное и первое возбужденное синглетные состояния обозначены через S0 и Sl. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных подуровней 1,2,3 и т. д. Переходы между различными подуровнями показаны стрелками.
Рис. 7.1. Схема расположения энергетических уровней и переходов молекулы
Возбуждение атомов и молекул при лазерном флуоресцентном анализе обычно происходит путем поглощения ими квантов лазерного излучения ближнего ультрафиолетового или видимого диапазонов. Этот процесс происходит за время порядка периода световых колебаний, т. е. примерно за 10-15 с. При этом молекула, как правило, оказывается на некотором высшем колебательном уровне или S2. Далее для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая безызлучательная релаксация на самый нижний колебательный подуровень Slt соответствующий термически равновесному состоянию. Этот процесс заканчивается, как правило, за время 10-12—10"п с. Дальнейший переход в состояние S0 сопровождается спонтанным процессом высвечивания квантов света. При этом если переход осуществляется непосредственно из состояния Si в состояние S0 без изменения спинов электронов, то такой переход относится к квантовомеханически разрешенным переходам. Типичное значение времени жизни этого возбужденного состояния составляет 10~8 с. Этот процесс и называют собственно флуоресценцией.
Если, однако, перед испусканием фотона в результате некоторого внутреннего энергетического перехода один из электронов молекулы изменит свой спин, то молекула оказывается в триплетном состоянии 7, переход из которого в основное синглетное состояние квантовомеханически не разрешен, т. е. его вероятность очень мала. Диапазон времени жизни этого состояния от 10-8 до 102 с. Такое испускание фотонов называется фосфоресценцией. Это излучение обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией и имеет существенно большую длительность при импульсном возбуждении.
Предметом нашего дальнейшего рассмотрения будет исключительно флуоресценция. Подчеркнем, что спонтанная эмиссия флуоресценции представляет собой случайный процесс и спонтанное излучение является некогерентным, в отличие, например, от упруго рассеянного излучения.
Многие важные биологические объекты характеризуются собственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие компоненты — флуорофоры. Так, около 90 % всей флуоресценции белков обусловлено наличием в них ароматической аминокислоты триптофана. Белки поглощают свет вблизи А,=280 нм, а наиболее сильно флуоресцируют в области Х=300—350 нм. Время жизни флуоресценции триптофана в белках лежит в диапазоне 1—7 не и зависит от типа белка и его третичной структуры. Также флуоресцируют в белках такие аминокислоты, как тирозин, фенилаланин, цистеин и цистин. Общая характеристика флуоресценции белков приведена в работах [6—8].
В синей и желто-зеленой областях спектра флуоресцируют восстановленные пиридин-нуклеотиды НАДН и НАДФН (>.=440—480 нм) и окисленные флавопротеиды (ФП) (X=510—540 нм). Эти вещества участвуют в таких важнейших внутриклеточных процессах, как гликолиз, цикл Кребса, дыхание. Поэтому практически любые сдвиги в клеточном метаболизме отображаются на динамике свойств НАДН и ФП, а она в свою очередь может быть выявлена при флуоресцентном анализе живых клеток и тканей. Один из таких примеров будет рассмотрен ниже.
Естественной флуоресценцией обладают также и другие кофакторы, ферменты, витамины, стероиды и гормоны. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно сами не флуоресцируют. Однако имеются некоторые исключения. Так, tRNA-Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи =470 нм, а время жизни около 6 не. В ближней УФ и видимой частях спектра флуоресцируют искусственно выращиваемые кристаллы оснований нуклеиновых кислот.
Собственной флуоресценцией в УФ диапазоне обладает сократительный аппарат, митохондрии и некоторые другие внутриклеточные структуры, причем интенсивность их флуоресценции зависит от физиологического состояния клеток и меняется при различных воздействиях на клетки.
Флуоресценция в красной части спектра обусловлена присутствием в живых клетках порфиринов.
Однако естественные флуоресцентные свойства многих биологических объектов выражены слабо и часто не дают возможности получить из эксперимента искомую информацию. В таких случаях в качестве меток, или зондов, используют другие естественные или искусственно синтезированные флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемому объекту, но имеют лучшие флуоресцентные свойства. Флуоресцентные зонды позволяют, например, количественно характеризовать такие физические свойства мембран, как поверхностный заряд, трансмембранный потенциал, микровязкость, расстояние между белками и липидами, концентрация воды в мембранах, изменение конформации белков и др. [7].
Использование флуоресцентных зондов позволяет проводить диагностику многих заболеваний, в частности иммунных, включая аллергию, токсикозы и атеросклероз. Регистрация флуоресценции искусственно вводимых в живые клетки и организмы флуоресцирующих красителей, например порфиринов и тетрациклинов, проводится также при диагностике раковых опухолей.
Видео: Кариотипы - зачем их сдавать
Флуоресценция всегда частично поляризована. Анизотропное световое возбуждение позволяет выделить из хаотической совокупности атомов или молекул определенную группу.
Поляризация флуоресценции несет информацию о поведении молекул между поглощением и испусканием фотонов, об ориентации молекул, их подвижности и взаимодействии с окружением.
Любой эксперимент с использованием лазерного флуоресцентного анализа сводится к селективному возбуждению флуоресценции исследуемого объекта или какой-либо его части лазерным излучением, измерению одного или нескольких из перечисленных выше параметров и оценке связи полученных результатов с изучаемым явлением в рамках той или иной модели.
Временной диапазон между поглощением излучения и его последующим испусканием достаточен для протекания целого ряда процессов, каждый из которых ведет к изменению наблюдаемой характеристики флуоресценции. К таким процессам относятся: столкновения с тушителями флуоресценции (например, с молекулами кислорода), вращательная и поступательная диффузия, образование комплексов с растворителем или с растворенными веществами и т. д. В результате регистрация спектров, времен жизни, квантовых выходов и анизотропии флуоресценции дает большую информацию о таких динамических процессах.
