Примеры применения лазерной флуоресцентной диагностики - лазерная диагностика в биологии и медицине
Примеры применения лазерной
флуоресцентной диагностики в медицине
Диагностика рака. Накопленный к настоящему времени опыт лечения онкологических заболеваний дает основание считать, что ранняя диагностика рака с последующим хирургическим или терапевтическим (возможно, лазерным) лечением могут существенно повысить вероятность выздоровления. В связи с этим в разных научных центрах, в том числе и в нашей стране, ведется поиск новых, более эффективных методов диагностики. Еще до применения лазеров было установлено, что спектры флуоресценции в видимом диапазоне, получаемые от нормальных и опухолевых тканей, отличаются. Применение лазерных флуоресцентных спектрометров с высокой спектральной плотностью мощности возбуждения позволило повысить скорость и качества получения спектров и поднять общий уровень исследований в этом направлении.
На рис. 7.3 показаны спектры флуоресценции, полученные от здоровых и опухолевых почки и предстательной железы крысы [12, 13]. Видно, что основные максимумы спектров от опухолевых тканей (А.=521—522 нм) существенно сдвинуты в синюю область по сравнению со здоровыми (А,= =531—533 нм). Да и сама форма спектров достоверно отличается. Подобные отличия спектров флуоресценции, по- видимому, должны наблюдаться и при исследовании тканей и органов человека. Эти отличия объясняются либо изменениями среды, окружающей флуорофоры, либо производством новых флуорофоров, индуцированным биохимическими изменениями в клетках или в окружающей их среде. В области длин волн А,=520—530 нм флуоресцируют флавины, причем максимумы спектров флуоресценции могут несколько смещаться в зависимости от условий среды. Следовательно, если не говорить о производстве новых флуорофоров, то можно предположить, что в данном случае флуоресцируют флавины. Общие пики в спектрах в области =590—640 нм можно приписать порфиринам, содержащимся в цитохроме митохондрий. Их флуоресценция многократно усиливается при удалении ионов Fe и Си.
Рис. 7.3. Спектры флуоресценции от почки (а) и предстательной железы (б) крысы: 1 — здоровый орган, 2 — опухолевый
Рис. 7.4. Схема лазерного флуориметра: 1 — Аг лазер, 2 — прерыватель, 3 — объект, 4 — фокусирующая система, 5 — монохроматор, 6 — ФЭУ, 7 — усилитель, 8 — самописец [121
Схема установки, на которой были получены приведенные выше спектры, изображена на рис. 7.4. Непрерывное излучение Аг лазера (^=488 нм), промодулированное с помощью прерывателя с частотой 200 Гц, фокусировалось на поверхность исследуемой ткани. Флуоресцентный сигнал с помощью системы линз направлялся на входную щель двойного монохроматора, который осуществлял развертку спектра с разрешением ДЛ,= 1,8 нм в диапазоне =500— 800 нм, так что рассеянный свет не попадал на фотоумножитель. Сигнал ФЭУ синхронно с прерывателем усиливался и регистрировался на самописце. Мощность зондирующего лазерного излучения составляла 100 мВт, диаметр пятна в области измерения — 100 мкм. Спектры снимались по нескольку раз, и при этом наблюдалась их полная воспроизводимость.
Заметим в качестве отступления, что такая же установка может, быть использована для диагностики кариеса зубов. Показано, что существуют достоверные различия в спектрах флуоресценции и упругого рассеяния в видимой области от пораженных кариесом и здоровых участков зуба. Более подробную информацию заинтересованный читатель найдет в [14].
Другой перспективный метод лазерной флуоресцентной диагностики рака основан на способности злокачественных клеток и тканей накапливать повышенную по сравнению с обычными клетками и тканями концентрацию флуоресцирующих красителей [15, П. 36]. Проведение оптического обследования тканей в спектральном диапазоне флуоресценции красителя дает возможность оперативно выявлять места его повышенной концентрации и, следовательно, локализации опухоли.
Использование лазеров в этой методике является принципиальным не только с точки зрения необходимости высокой спектральной плотности мощности излучения, но также с точки зрения необходимости использования световолоконных трактов для подведения возбуждающего излучения к внутренним органам и отведения оттуда флуоресценции.
Выбор оптимального красителя для флуоресцентной диагностики опухолей проводится в соответствии с рядом требований. Красителю должны быть свойственны: высокая селективность накопления в злокачественных клетках и тканях (по сравнению с нормальными), высокий квантовый выход флуоресценции, быстрое выведение из организма, отсутствие побочных эффектов на ткани и организм в целом. Не должен быть высоким квантовый выход фотоиндуцированной генерации синглетного кислорода или каких-либо других циготоксических агентов в отличие от противоположного требования к красителям, используемым для фото динамической терапии опухолей.
В настоящее время в лабораториях, разрабатывающих методику лазерной флуоресцентной диагностики рака, чаще всего используются в качестве красителей гематопорфирин (ГП), производные гематопорфирина (ПГП) [П. 36, 16, 171 и флюренат (динатриевая соль флюоресцеина) [15, 18]. В то время как первые два красителя используются также и для фотодинамической терапии, флюренат оказывается более подходящим именно для диагностики. Так, он обеспечивает контрастность наблюдения опухоли в свете флуоресценции на фоне нормальных тканей не менее 50 : 1 по сравнению с 5 : 1 у ПГП.
Для возбуждения флуоресценции флюрената больше всего подходит излучение Не—-Cd лазера (Л,=441,6 нм), попадающее в полосу его поглощения. При наличии у больного, в кровь которого введен флюренат, злокачественной опухоли, например желудочно-кишечного тракта, эта опухоль светится салатовым светом на темно-синем фоне непораженной слизистой. Это свечение с достоверностью 98 % соответствует месту нахождения опухоли. Некротическая ткань дает несветящиеся участки. Такие участки часто наблюдаются на крупных опухолях, которые в целом светятся слабее.
В ряде случаев площадь свечения при лазерном возбуждении значительно превышает область опухоли, видимую при обычном освещении. Это означает высокую инфильтрацию злокачественной ткани в стенку органа. Такое наблюдение позволяет правильно спланировать операцию.
Метастазы светятся так же, как и опухоли. Применение флуоресцентной диагностики существенно увеличивает процент их выявления. В некоторых случаях только благодаря флуоресценции обнаруживается внутриорганное метастазирование в виде просовидных высыпаний вдали от опухоли.
Интересно отметить имевшиеся в практике случаи [15], когда у больных с диагнозами рака, например, толстой кишки, поставленными пальпаторно и рентгенологически, не наблюдалось флуоресцентного свечения. Даже во время операции диагноз рака не вызывал сомнения. Однако последующее гистологическое исследование этот диагноз не подтвердило: за опухоль были приняты воспалительные инфильтраты. Эго показывает высокую надежность лазерной флуоресцентной диагностики.
В настоящее время продолжаются работы по клиническому испытанию этого метода и по исследованию механизмов избирательного накопления красителей в раковых клетках [17, 19], а также по изучению механизмов фотодинамического повреждения биомолекул, клеток и биоструктур тканей [20, 211. Важным этапом этих работ является изучение стационарных и разрешенных во времени спектров флуоресценции красителей в растворах и в живых клетках, которое проводится с помощью лазерных пикосекундных спектрометров и микроспектрофлуориметров.
В работах [22, 23] регистрировались флуоресцентные спектры ГП, диацетата ГП (ДГП) и дигематопорфиринэфира (фотофрина 2) в водных растворах (рН=4,0—11,0), в фосфатном буферном растворе (рИ=7,4) и в растворе диметилформамида в модельных системах: искусственных липидных пузырьках — липосомах и тенях эритроцитов, а также в культивируемых клетках почки свиньи и фибробластов человека.
Схема установки, на которой были получены эти спектры, изображена на рис. 7.5.
Рис. 7.5. Схема пикосекундного флуоресцентного микроскопа: 1 — фокусирующий объектив, 2 — объект, 3 — монохроматор, 4 — ФЭУ, 5 — счетчик фотонов, 6 — микро-ЭВМ [22]
Флуоресценция возбуждалась одиночными импульсами либо второй гармоники АИГ : Nd лазера, либо импульсами лазера на красителе длительностью 70±10 пс. Короткофокусный объектив фокусировал возбуждающий лазерный луч на объект и собирал флуоресценцию. Диаметр пучка в области зондирования был меньше 1 мкм. Флуоресцентное излучение направлялось сквозь
прозрачное в диапазоне 600—700 нм дихроичное зеркало на монохроматор и далее на ФЭУ, работающий в режиме счета фогонов. Вся система функционировала под управлением микро-ЭВМ.
В клетках главный максимум флуоресцентного спектра приходится на 635 нм. Стационарные спектры имеют максимумы на 612 нм для водных растворов и на 625 нм — для
Рис. 7.6. Распределение интенсивности флуоресценции по раковой клетке человека, сенсибилизированной ПГП [25]
органического растворителя. Это говорит о том, что характер флуоресценции молекул красителя существенно зависит от их непосредственного окружения (молекул воды, растворителя, липидов и др.).
Кинетические измерения показали, что характер затухания флуоресценции зависит от того, находятся молекулы красителя в форме мономеров или имеет место их агрегация и комплексообразование с другими, например внутриклеточными, структурами. Так, кинетика затухания флуоресценции от раствора мономеров ГП в воде в области максимума с хорошей точностью моделируется одной экспонентой с временем т=15—16 не. Появление в растворе агрегатов (олигомеров) красителя влечет за собой появление еще одной «быстрой» экспоненты с т=0,5 не. Быстрая кинетика появляется также в полосе главного максимума спектров флуоресценции молекул красителя в клетках, что указывает на то, что эти молекулы образуют комплексы с внутриклеточными структурами, скорее всего с мембранами.
При повышении дозы светового воздействия в растворах красителей возникают устойчивые фотопродукты, дающие в кинетических и стационарных спектрах флуоресценции боковые полосы с пикосекундным затуханием (для ГП ?.тах=644 нм, т=100 пс) [24]. На рис. 7.6 приведен пример измерения распределения интенсивности флуоресценции по раковой клетке человека после 1-часового содержания ее в растворе ПГП [25]. Концентрация красителя составляла 50 мкг/см3, плотность мощности излучения аргонового лазера на поверхности клетки — около 0,4 мВт/см2. Отношение сигнал/шум составляло несколько десятков в области максимальной флуоресценции. Измерения проводились на лазерном флуоресцентном микроскопе, оборудованном высокочувствительной системой регистрации, цифровой обработки и представления изображений.
Видно, что интенсивность флуоресценции меньше в центральной части, чем в периферийных областях. Этот результат означает, что ПГП накапливается главным образом в области внешней мембраны культивируемых раковых клеток, что соответствует результатам других авторов [26]. Учитывая этот факт, а также представления о комплексообразовании молекул красителей с мембранами, можно предположить, что разрушение раковых клеток при фото- динамической терапии опухолей развивается в основном в мембранах клеток.
На приведенном рисунке размеры минимального элемента изображения соответствуют области в 0,25 мкм на исследуемом объекте, что находится на грани пространственного разрешения оптической системы. Время получения флуоресцентного изображения составляет 1 с в отличие от нескольких десятков секунд, необходимых при использовании обычной техники, дающей к тому же недостаточное пространственное разрешение.
Увеличивающееся с каждым годом число работ в области развития и испытания методик лазерной флуоресцентной диагностики злокачественных образований позволяет надеяться на то, что в недалеком будущем эти методики вместе с лазерной фотодинамической терапией рака займут прочное место в клиниках.
Диагностика ишемии сердечной мышцы. Многие флуориметрические исследования живых клеток основаны на регистрации отношения концентраций восстановленной и окисленной форм пиридин-нуклеотидов [НАДН]/[НАД+], являющихся коферментами многих внутриклеточных реакций. Это отношение несет важную информацию о состоянии клеток и состоящих из них тканей и органов. Возможность ее флуоресцентной регистрации определяется свойствами НАДН поглощать свет на длине волны Хх=340 нм и высвечивать флуоресценцию с максимумом на длине волны Я2= =480 нм. НАД+ на длине волны не поглощает, а его флуоресценция в области Я2 существенно слабее.
Одним из интересных примеров применения этого подхода является регистрация ишемии сердечной мышцы в нормальных физиологических условиях [13]. Характерной особенностью работы с перфузируемыми кровью органами
Рис. 7.7. Схема лазерного волоконного флуориметра [13]
является сильное возмущение, вносимое в сигнал флуоресценции тканевой циркуляцией крови. Компенсировать это возмущение оказалось возможным путем одновременной регистрации интенсивности флуоресценции на длине волны , и интенсивности отраженного тканью излучения в максимуме полосы поглощения гемоглобина (Я3=805 нм).
4На рис. 7.7 изображена схема лазерного волоконного флуориметра, созданного для подобных измерений. Устройство включает в себя два лазера: азотный (/) и на красителе (2), как источники УФ и ИК излучения, два фотодиода (3), регистрирующих отношение выходных мощностей лазеров, два ФЭУ (4), измеряющих интенсивность флуоресценции, индуцированной УФ излучением, и интенсивность отраженного ИК излучения. Эта схема, естественно, снабжена электронным блоком и микро-ЭВМ. Параметры азотного лазера: частота повторения импульсов 140 Гц, энергия в импульсе 150 мкДж, пиковая мощность 30 кВт, средняя мощность при частоте повторения импульсов 100 Гц —
мВт. Длительность импульса лазера на красителе при той же частоте повторения — 6 не.
В качестве иллюстрации результата применения описанного прибора для регистрации ишемии сердечной мышцы на рис. 7.8 приведена временная зависимость интенсивности отраженного света (/) и флуоресценции (2) во время приступа ишемии (остановки перфузии) изолированной перфузируемой модели сердца крысы. Уменьшение отражения
Рис. 7.8. Кинетика изменения отражения (1) и флуоресценции (2) во время приступа ишемии, вызванной остановкой перфузии сердца крысы_(момент tx) и возобновленной через 50 с (момент t2)
происходит за счет уменьшения концентрации внутритканевых красных кровяных телец, в то время как увеличение интенсивности флуоресценции происходит за счет увеличения внутриклеточного отношения [НАДН]/[НАД+].
Лазерный волоконный флуориметр может с успехом применяться при операциях на сердце для изучения метаболизма сердечной мышцы через световодный катетер. Более того, очевидно, что любой орган, доступный для фиброскопа или катетера, может быть объектом изучения с помощью такого флуориметра. Заметим, что нелазерный флуориметр, построенный ранее на базе ртутной лампы, монохроматора, фильтров и УФ микроскопа, не позволял получать достоверные результаты главным образом из-за недостатка чувствительности.
Диагностика атеросклероза. Еще одним перспективным применением флуоресцентной диагностики в медицине становится диагностика атеросклеротических бляшек и, в частности, фиброзных бляшек, являющихся первой стадией атеросклеротического поражения сосудов.
Как показано в работе [26], наличие в сосуде атеросклеротической бляшки может быть определено путем сравнения интенсивности флуоресценции на длинах волн 580 и 600 нм при возбуждении на длине волны 480 нм. На рис. 7.9
Рис. 7.9. Спектры флуоресценции от нормальной (/) и пораженной атеросклерозом (2) артерий [26]
представлены характерные спектры флуоресценции, полученные от нормальной и пораженной атеросклерозом артерий. Видно, что они сильно отличаются.
Используя тот факт, что высота пика на 600 нм относительно минимума, приходящегося на 580 нм, намного больше в случае здоровых артерий по сравнению с пораженными, можно составить отношение контраста /(600)//(580). Значение этого отношения, полученное в экспериментах, подтвержденных соответствующим гистологическим анализом, равно примерно 2 для нормальных артерий и примерно 1 для атеросклеротических.
Многочисленные эксперименты показывают, что можно достоверно различать нормальную артерию и артерию, имеющую бляшку толщиной 0,5 мм и более. И хотя к настоящему времени результаты получены только на трупных артериях, можно рассчитывать, что прямая лазерная диагностика атеросклероза in vivo через световодный катетер скоро станет возможной. При этом в случае положительного диагноза можно будет по тому же катетеру передавать большие дозы лазерного излучения в область поражения сосуда атеросклерозом с целью разрушения бляшек.
