Лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния - лазерная диагностика в биологии и медицине

ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КВАЗИУПРУГОГО РАССЕЯНИЯ
В этой главе рассмотрены возможности использования лазерного светорассеяния для изучения динамических характеристик биологических микрообъектов: коэффициентов диффузии, скоростей направленного транспорта и миграционного движения, параметров внутримолекулярной и внутриклеточной подвижности. По этим измеряемым характеристикам можно рассчитывать размеры, массу и ряд других характеристик рассеивателей. Это область так называемого квазиупругого светорассеяния, при котором не происходит существенного изменения длины волны зондирующего излучения в отличие от комбинационного рассеяния, которое будет рассмотрено в гл. 6.

3.1. Физические основы метода. Основные типы спектрометров

Физические основы. Пусть на среду, содержащую подвижные рассеивающие частицы, падает монохроматическая линейно поляризованная световая зондирующая волна Е3 с волновым вектором д3 (рис. 3.1). Так же, как в эксперименте по упругому светорассеянию, рассеянная волна регистрируется в удаленной точке под углом 0. Она характеризуется волновым вектором gv. Если пренебречь возможностью многократного рассеяния и взаимодействием частиц друг с другом, то рассеянный свет можно представить как сумму независимых вкладов от N одновременно рассеивающих частиц:

где Ep0j — амплитуда световой волны, рассеянной на /-й частице с зависящей от времени координатой г,(0, Ф- — фаза /-й рассеянной волны, определяемая через разностный волновой вектор рассеяния q=qv—q3 как Oj=qrj(t).
Как уже говорилось, при квазиупругом рассеянии =2яп/к. Следовательно, чисто геометрически из
Рис. 3.1. Геометрия эксперимента по квазиупругому светорассеянию
рис. 3.1 можно получить для модуля волнового вектора рассеяния выражение
(3.1)
Следует заметить, что кроме координаты центра масс частицы от времени могут зависеть и амплитуды Ep0j, например, при изменении в процессе измерения рассеивающих свойств, конфигурации или конформации частиц, при вращательном движении несферических частиц и в ряде других случаев. В результате для рассеянной волны получаем выражение
(3.2)
Отсюда видно, что, регистрируя временные изменения (динамику) амплитуды и фазы (частоты) рассеянного излучения, можно в принципе получить большую информацию о динамических параметрах рассеивателей. Еще раз подчеркнем, что квазиупругое рассеяние определяется сравнительно медленными динамическими процессами с характерными временами в диапазоне 10&ldquo-*—1 с, что существенно больше характерных времен быстрых внутримолекулярных колебаний, определяющих неупругое взаимодействие излучения с биомакромолекулами (см. гл. 6).
Временные изменения параметров квазиупруго рассеянного излучения проявляются в изменении его корреляционной функции или, что то же самое, в изменении его частотного спектра. В зависимости от характера движения рассеивателей оптический спектр либо только уширяется, либо у него появляются дополнительные максимумы на сдвинутых частотах. Однако эти уширения и сдвиги, составляющие в зависимости от исследуемого объекта, как правило, от 10 Гц до 10 МГц, настолько малы по сравнению с частотами оптического диапазона (около 5-1014 Гц), что зарегистрировать их традиционными методами оптической спектроскопии не представляется возможным — даже самые лучшие оптические спектрометры с интерферометрами Фабри — Перо не позволяют различить в оптическом спектре компонент, расположенный ближе 10 МГц. Следовательно, для решения поставленных задач необходимо осуществлять спектральный анализ со сверхвысоким разрешением.
Это стало возможным после разработки в 60-х годах метода оптического смешения (ОС), вошедшего в широкую практику только с появлением лазеров. Суть этого метода состоит в том, что при смешении на квадратичном фотоприемнике (фотодиоде, фотоумножителе) световых волн разных частот на выходе этого фотоприемника образуется электрический сигнал, промодулированный разностными частотами. Так как в рассматриваемом нами случае эти частоты близки, то сигнал имеет характер биений, спектр которых однозначно связан со спектром рассеянного света. При этом, как уже говорилось, он расположен в диапазоне низких частот и может быть подвергнут анализу уже не оптическими, а радиотехническими средствами, дающими вполне достаточное спектральное разрешение (вплоть до долей герца). Теория и методы практической реализации ОС при регистрации квазиупругого светорассеяния описаны во многих книгах и обзорах (см., например, [1—15]).
Типы спектрометров ОС. Рассмотрим принципы действия двух основных разновидностей этих спектрометров. Монодинные спектрометры (МС), называемые также иногда гомодинными, работают по принципу выделения частот самобиений различных спектральных компонентов рассеянного света. Схема МС изображена на рис. 3.2. В МС на фотоприемник подается только рассеянное исследуемыми частицами поле Ер. Фотоприемник, как говорилось выше, регистрирует не напряженность, а квадрат напряженности поля. Поэтому выходной ток 1фп оказывается пропорциональным величине | р|2. Коэффициент пропорциональности зависит от квантовой эффективности приемника и от когерентных свойств рассеянного света. Именно для того, чтобы весь свет, регистрируемый приемником, был когерентным, т. е. чтобы все волны, рассеянные различными частицами исследуемого объекта, попадали на фоточувстви- тельную поверхность приемника в фазе, телесный угол
сбора 0 рассеянного излучения в спектрометрах ОС обычно ограничивается диафрагмами. В случае МС угол когерентности удобно оценивать выражениемгде I — характерный размер зондируемой области [9].
Выполняя операцию возведения в квадрат выражения (3.2) и вычисляя спектр мощности фототока, можно показать,

Рис. 3.2. Схема лазерного МС: 1—лазер, 2— аппаратура обработки сигнала, 3 — лимфрагмы, 4 — линзы, 5 — фотоприемник
что этот спектр состоит из трех компонентов: постоянной составляющей, дробового шума и спектра флуктуаций интенсивности регистрируемого поля, как раз и несущего полезную информацию. Заметим, однако, что в МС оптический спектр без искажений повторяется в спектре фототока только в случае гауссовой статистики рассеянного поля. Это, как правило, выполняется, если число одновременно рассеивающих частиц, дающих вклад в регистрируемое поле, N^> 1.
Принципиальным отличием гетеродинных спектрометров (ГС) оптического смешения от МС является то, что на фотоприемник кроме рассеянного исследуемым объектом излучения подается опорная (гетеродинная) волна ЕГ с фиксированной частотой. Интенсивность этой волны должна бьпь во много раз больше интенсивности рассеянного поля. В качестве опорного, как правило, используется часть излучения того же лазера, который возбуждает рассеяние. Оно может подводиться на фотоприемник либо с помощью системы зеркал, как на рис. 3.3, либо это может быть излучение, рассеянное на неподвижных рассеивателях, расположенных вблизи измерительного объема, например, на стенках кюветы. В некоторых случаях для получения опорного излучения может использоваться второй лазер, синхронизованный с первым.
Эффективное оптическое смешение рассеянной и опорной волн на фотоприемнике в ГС происходит только при согласовании их волновых фронтов. Это означает, что геометрия расположения элементов установки, определяющая углы сбора и падения на фотоприемник рассеянной и опорной волн, должна быть такой, чтобы эти волны были когерентными. Это обстоятельство создает определенные трудности в настройке ГС. Однако трудности окупаются преимуществами ГС по сравнению с МС, которые в некоторых случаях оказываются принципиально важными.
Одно из преимуществ вытекает из того, что при условии | г|^>| р| и высокой эффективности смешения этих волн

Рис. 3.3. Схема лазерного ГС: обозначения те же, что и на рис. 3.2,
6 — зеркала
полезная составляющая сигнала г`фП оказывается пропорциональной интенсивности опорного пучка. Это обстоятельство позволяет добиться выигрыша в величине полезного сигнала.
Принципиально важным также является то, что у ГС информативная составляющая спектра мощности фототока, также включающего в себя постоянный и шумовой компонент, повторяет оптический спектр независимо от статистики рассеянного поля. Кроме того, ГС в отличие от МС чувствительны не только к движениям рассеивателей типа равновесной диффузии, рассасывающихся флуктуаций и случайных миграций, но и к направленным движениям. Эта особенность ГС выявляет их близкое родство с лазерными доплероским анемометрами (ЛДА) — приборами, предназначенными специально для измерения скоростей потоков жидкостей и газов [13, 14].
Как уже видно из названия, принцип работы этих приборов основан на регистрации сдвигов частоты излучения, рассеянного движущимися частичками. Появление этих сдвигов в рассеянном свете в простейшем случае, когда рассеиватели движутся в одном направлении с постоянными скоростями, видно из анализа выражения (3.2). Действительно, если rj(t)=r0j(t)+v0jt, то

е. фазы рассеянных волн изменяются линейно по времени. Так как частота волны есть производная по времени от фазы, то это и означает, что в данном случае рассеянный свет приобретает постоянные сдвиги частоты
(3.3)
имеющие доплеровское происхождение. Здесь <р — угол между направлениями векторов q и V. Все множество доплеровских сдвигов частоты, содержащихся в рассеянном свете, называется доплеровским спектром. Обращает на себя

Рис. 3.4. Схема дифференциального ЛДА: обозначения те же, что на рис. 3.2 и 3.3
внимание линейная зависимость доплеровских сдвигов частоты от скоростей движения рассеивающих частиц.
В качестве одного из примеров, взятых из большого разнообразия схем ЛДА, разработанных к настоящему времени [14], рассмотрим изображенную на рис. 3.4 так называемую дифференциальную схеиу, применяющуюся в биомедицинской диагностике [7]. В этой схеме область измерения (или, как часто говорят, измерительный объем) формируется пересечением двух зондирующих пучков одинаковой интенсивности и элементами приемной системы, включающей в себя в простейшем случае линзу и две диафрагмы. Выходной сигнал фотоприемника так же, как в ГС, образуется в результате оптического смешения на его фотокатоде двух полей. Однако в данном случае смешиваются поля, рассеянные от обоих зондирующих пучков. Особенностью дифференциальной схемы ЛДА является то, что согласование волновых фронтов двух рассеянных волн достигается автоматически в широком телесном угле. Благодаря большой приемной апертуре дифференциальных ЛДА, они часто используются при измерениях в слабо рассеивающих средах. Визуализация измерительного объема в области пересечения зондирующих пучков также дает дополнительные удобства.
Из сказанного выше ясно, что ЛДА и ГС представляют собой приборы одного типа. Различие в названиях носит исторический характер и подчеркивает разные стороны одного и того же принципа измерения: ЛДА предназначены исключительно для исследования направленных ламинарных и турбулентных потоков, в то время как ГС часто используются также и для изучения ненаправленных (диффузионных) процессов переноса. В обоих типах приборов искомая информация получается, как правило, из корреляционных функций или спектров мощности сигналов фотоприемника. Поэтому в литературе используются и такие названия, как корреляционные или доплеровские спектрометры.
На практике обработка выходного электрического сигнала каждого из этих спектрометров выполняется аналоговыми или цифровыми методами, которые мы обсудим в следующем параграфе, а сейчас рассмотрим требования, предъявляемые к основному элементу всех спектрометров ОС — лазеру. Именно благодаря монохроматичности, когерентности и высокой направленности лазерного излучения стало возможным эффективно осуществлять ОС. В абсолютном большинстве случаев в спектрометрах ОС, предназначенных для исследования биологических объектов, используются непрерывные одномодовые Не—Ne лазеры. Мощности серийно выпускаемых Не—Ne лазеров (1— 50 мВт) вполне хватает для получения достаточной для регистрации интенсивности рассеянного света.
Основная проблема выбора мощности зондирующего пучка состоит в том, чтобы не внести возмущений в исследуемый объект. Особенно это касается живых объектов — клеток, а также других объектов, сильно поглощающих свет. Использование многомодовых лазеров может привести к погрешностям в измерениях в связи тем, что расстояние по частоте между соседними поперечными модами может быть сравнимо с характерными изменениями в спектрах, имеющими место при рассеянии на биологических объектах.
Если говорить о выборе длины волны, то здесь важно, что чем она меньше, тем сильнее рассеивается свет. Кроме того, диффузионное уширение спектров обратно пропорционально квадрату длины волны. Следовательно, чем меньше , тем шире спектр и тем мягче требования к системе обработки сигнала. Поэтому в ряде случаев в спектрометрах ОС используются непрерывные аргоновые лазеры, генерирующие в сине-зеленой области длин волн. При выборе длины волны, конечно, следует учитывать спектр поглощения исследуемого объекта. На практике Не—Ne лазеры оказываются предпочтительней в силу меньшей стоимости и большей компактности. Конкретный тип лазера выбирается также из соображений стабильности излучения, так как технические флуктуации уменьшают отношение сигнал/шум.