Абсорбционно-трансмиссионный анализ с использованием перестраиваемых лазеров - лазерная диагностика в биологии и медицине
АБСОРБЦИОННЫЕ И КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ
При решении целого ряда диагностических задач в биологии и медицине хорошо себя зарекомендовали абсорбционные методы, которые обычно применяются в лазерной аналитической спектроскопии или спектроскопии ультрабыстрых процессов, [П. 1 — П. 3, П. 40 — П. 43, 1.12, 1]. Эти методы относятся к методам микродиагностики, поскольку в них используется информация об атомной и молекулярной структуре исследуемого вещества биообъекта. Схематическое представление некоторых методов микродиагностики дано на рис. 5.1. В общем случае к абсорбционным методам относятся как абсорбционно-трансмиссионные, основанные на измерении интенсивности падающего /» и прошедшего / света разных длин волн, так и методы, основанные на регистрации поглощенной энергии путем измерения температуры АТ нагрева биообъекта (оптико-калориметрические методы) или интенсивности /ф его флуоресценции (лазерный флуоресцентный анализ).
Поскольку лазерный флуоресцентный анализ в применении к биологии получил весьма широкое распространение и имеет самостоятельное значение, он будет рассмотрен в отдельной главе, а здесь будут обсуждены возможности абсорбционно-трансмиссионных методов, а также перспективы применения оптико-калориметрических методов. Классификация абсорбционных методов диагностики и некоторые их модификации даны на схеме 2.
Абсорбционно-трансмиссионный анализ
с использованием перестраиваемых лазеров
Методика измерений, предельная чувствительность. Измерение спектра пропускания вещества в различных агрегатных состояниях является основой спектрофотометрического способа, который успешно применяется на протяжении многих лет в различных областях науки, в том числе в биологии и медицине. Его отличает чрезвычайная простота, универсальность, сравнительно высокая чувствительность и точность анализа, вполне достаточные при решении многих задач биомедицины.
2. Классификация абсорбционных методов диагностики и некоторые их модификации
Рис. 5.1. Схематическое представление ряда методов микродиагностики
Измерение спектра пропускания основано на регистрации интенсивности падающего (/0) и интенсивности прошедшего в поглощающей среде путь г света (/) в зависимости от длины волны к:
(5.1)
(5.2)
где а (А,) — коэффициент поглощения- а ( ,) — эффективное сечение поглощающих частиц (см2)- N — их концентрация (см-3). Предполагается, что интенсивность падающего света очень мала. Для небольших коэффициентов поглощения, когда ехр(—az)«l—аг, легко найти, что
(5.3)
В нелазерных спектрофотометрах используются широкополосные источники света, а перестройку по длинам волн осуществляют с помощью призм или дифракционных решеток. Для узких линий поглощения чувствительность зависит не только от способности прибора зарегистрировать малые изменения А/ на фоне значительного прошедшего сигнала, но и от разрешающей способности прибора. Обычно предельная чувствительность достигается при А///>10-4— 10-5.
Использование лазеров позволяет: 1) существенно повысить спектральную разрешающую способность метода, определить форму и структуру линий поглощения молекул- 2) для узких линий поглощения несколько повысить чувствительность- 3) в некоторых случаях упростить и удешевить экспериментальную установку, поскольку монохрома- гор (обычно составляющий наиболее объемную и дорогую часть установки) при наличии лазера оказывается ненужным (следует помнить, что некоторые перестраиваемые лазеры также представляют собой технически сложные и дорогие устройства)- 4) за счет высокой спектральной плотности излучения лазеров снизить влияние шумов фотоприемного устройства (сам лазер за счет нестабильности выходной мощности и частоты может внести погрешности в результаты измерений, поэтому необходим контроль или стабилизация параметров лазера, что довольно просто реализуется на практике)- 5) за счет высокой направленности и пространственной когерентности лазерного излучения осуществить дистанционные и трассовые измерения поглощения. В случае измерения слабых поглощений в газах и жидкостях можно применять многоходовые кюветы, насчитывающие до 30—100 проходов [П. 42], а также полые стеклянные и кварцевые оптические волокна длиной до 150 м [П. 43].
Преимущества лазерных источников света особенно проявляются в ИК области спектра при исследованиях отдельных вращательных линий колебательных полос, которые обычными спектральными приборами не разрешаются.
Итак, пороговая чувствительность абсорбционного метода определяется способностью регистрирующей аппаратуры определять наименьшее значение отношения A/min/7. Чувствительность метода может быть охарактеризована по- Разному [П. 42]. Пороговая чувствительность по оптической плотности
или по коэффициенту поглощения
где I — длина образца. Обычно система регистрации с использованием лазеров обеспечивает значение A/min//=10-5.
Минимальное число детектируемых на пути лазерного пучка радиуса w молекул
их концентрация
а также минимально обнаруживаемая концентрация примесных молекул
При а>=0,6 см, сг=10-17 см2, /=10 см, N0= 1018 см-3 (полное число молекул) и Д/т1п//=1и-6 имеем Afmln«1012- Nmin«10u см-3>` «min «10-® см-1- Cmin «10-7 (100 ppb) [П. 42]. Это характеристика следовых количеств одного вещества в другом: ррш (млн-1, частей на миллион, мкг/г)- ppb (млрд-1, частей на миллиард, нг/г)- ppt (трлн-1, частей на триллион, пг/г).
Применения многоходовых кювет, модуляционных и дифференциальных методик измерения полезного сигнала, позволяют существенно повысить чувствительность метода. Если амплитудная модуляция интенсивности зондирующего излучения и модуляция поглощения могут быть реализованы для любых источников света, то многократное прохождение среды (до 100 раз) и частотную модуляцию зондирующего излучения можно получить только при использовании лазеров. Таким образом была реализована рекордная для ИК спектрометров на инжекционных лазерах пороговая чувствительность amln »3-10-10 см-1. Для лазерных спектрометров из-за высокой когерентности света сильным мешающим фактором являются интерференционные эффекты в оптической схеме устройства. Этим в основном и определяются достигнутые значения аю1п [П. 42].
Существенно повысить чувствительность метода (в 102— 10Б раз) можно при использовании внутрирезонаторного поглощения, когда кювета с исследуемым веществом размещается внутри резонатора [П. 42, П. 43, 1.12]. Это повышение происходит по трем главным причинам. Во-первых, автоматически реализуется большое число проходов (до нескольких сотен, если исследуемый объект не вносит значительных потерь). Во-вторых, благодаря характерной для лазеров зависимости выходной мощности от потерь в резонаторе устраняется основная причина малой чувствительности абсорбционного метода, поскольку фактически измеряется не отношение А///, а само значение А/. И в-третьих, в режимах генерации связанных волн (многомодовый двухзеркальный лазер или кольцевой лазер) эффекты конкуренции связанных волн существенно повышают чувствительность лазеров к изменениям потерь внутри резонатора.
Внутрирезонаторный метод перспективен для регистрации очень слабых линий поглощения веществ, загрязняющих атмосферу, короткоживущих продуктов химических (биохимических) реакций, радикалов и нестабильных молекул. Для создания высокочувствительных спектрометров, работающих на принципе измерения внутрирезонаторного поглощения, в большей степени подходят перестраиваемые лазеры с широкими линиями и значительным запасом по усилению. В видимой области — это лазеры на красителях, в ИК области — лазеры на центрах окраски.
Основные области применения в биологии и медицине. Абсорбционно-трансмиссионный анализ весьма универсален и может быть с успехом применен при исследовании газов, жидкостей и твердых тел. Исследование сред в различных агрегатных состояниях является предметом биомедицинской диагностики. Газовый анализ, например, необходим при определении газообразных компонентов жизнедеятельности живых организмов, определении следовых концентраций загрязняющих веществ (задачи санитарии и профпатологии) и пр.
Для лазерного контроля загрязнений атмосферы разработаны многочисленные средства, многие из которых основаны на измерении поглощения [П. 40, П. 42]. Контроль осуществляют путем отбора проб с последующим абсорбционным анализом в многоходовых кюветах пониженного давления. Проводят трассовые измерения поглощения загрязняющих компонентов с применением разнесенных источника света и фотоприемника, удаленных зеркального отражателя или естественного рассеивателя, используя при этом дифференциальные методики измерений. Применяют также гетеродинные измерения.
Обычно загрязнители имеют характерные линии поглощения в ИК области спектра, поэтому наиболее часто используются лазерные спектрометры на основе инжекционных и молекулярных СО и С02 лазеров, обеспечивающих необходимую перестройку в диапазоне 2,5—46,2 мкм.
С инжекционным лазером порог обнаружения таких загрязнителей воздуха, как SO2, N20, NH3 и N02, находится в пределах от 1 ррb до 10 ppt, а для НСl — 0,1 ppm, HF — 0,5 ррш. Можно определять содержание HCN, Н20, СН4, С2Нв в сигаретном дыме, а также содержание токсических
примесей в выхлопных газах автомобилей, например бензола, на уровне 1 ppm [П. 42]. Для С02 лазера с дискретной перестройкой частоты измерения при атмосферном давлении методом дифференциального поглощения (зондирование атмосферы на двух длинах волн) дают порог обнаружения типичных органических молекул загрязнителей порядка 2,5-10-7—5,5* 10—5% на одном километре [П. 40].
Биологические объекты по большей части представляют собой конденсированные среды — жидкости или твердые тела. Линии поглощения таких сред значительно уширены, поэтому в принципе не требуется высокая степень монохроматичности лазерного излучения. Однако лазеры и в этих случаях оказываются весьма полезными. Во-первых, узкая линия их излучения позволяет отстраиваться от центра линии поглощения сред с высокой оптической плотностью и тем самым обеспечивать линейную зависимость поглощения от концентрации. Во-вторых, высокая спектральная яркость лазеров позволяет проводить измерения поглощения в оптически плотных образцах. Например, для инжекционных лазеров Dmax = (a/)max«12 [П. 42].
Биологические среды — это оптически неоднородные среды, поэтому они, как правило, сильно рассеивают свет. Это обстоятельство в значительной мере усложняет или даже делает невозможным измерение спектров пропускания, вызывает необходимость переходить к другим способам измерения спектров поглощения. При наличии рассеяния коэффициент а (А,) из (5.1), (5.2) имеет уже смысл коэффициента ослабления и определяется концентрацией не только поглотителей, но и рассеивателей на пути лазерного пучка. Выражения (5.1) и (5.2) сохраняют свою форму, однако а=ст0. Эффективное сечение ослабления учитывает как поглощение, так и рассеяние:
Для сферических частиц радиуса а
коэффициенты Qn и Qp в общем случае определяются на основании теории Ми. Максимальное значение этих коэффициентов достигается при и составляет 1—5 [П. 40]. При наличии многих компонентов, поглощающих и рассеивающих свет, что также характерно для биосистем, (5.2) имеет вид
где а0*=стпг+огрг, Nt — концентрация частиц t-ro компонента.
Очевидно, что в таких условиях в рамках спектрофотометрической методики поглощение уже не может быть определено без привлечения характеристик рассеяния. Для сравнительно прозрачных сред используют комбинированные методики, в основе которых лежит измерение спектров диффузного отражения биообъектов и спектров пропускания. Например, при исследованиях параметров крови (определении процентного содержания кислорода в цельной крови, концентрации общего (тотального) гемоглобина крови, концентрации метагемоглобинов) представляет большой интерес метод, использующий измерение диффузного коэффициента отражения Rn и относительного пропускания слоев крови двух толщин т12 [2, 3]. В этом случае показатель поглощения единичной толщины
где /2 и /х — толщины двух слоев- у — параметр, определяемый по измеряемому коэффициенту отражения
Лазеры довольно успешно используются для диагностики различных заболеваний, хотя пока лазерные методы не приобрели должной популярности. В [П. 39] представлен краткий обзор методов медицинской диагностики, написанный в основном по материалам зарубежных патентов, многие из которых используют абсорбционные или комбинированные методики измерений. Например, предлагается простой и быстрый способ подсчета эритроцитов и тромбоцитов, основанный на измерении интенсивности прошедшего и рассеянного света на длинах волн сильного поглощения эритроцитов (415 или 540 нм). Частицы крови проходят по одной через область, освещаемую излучением. В качестве источников света может быть взят либо лазер на красителях, либо Ат лазер с А=413,1 нм. Перспективен для этих целей и Не — Ne лазер с ,=543,3 нм.
Можно реализовать подсчет и классификацию частиц крови по размеру и их жизнеспособности при измерениях интенсивности поглощенного частицей излучения Не — Ne лазера с ,=632,8 нм. С использованием этого лазера можно также определять концентрацию жизнеспособных тромбоцитов в пробе крови, предназначенной для переливания. Обзор оптических методов и устройств для счета частиц, в том числе и биологического происхождения, взвешенных
в жидких средах, дан в [П. 48]. Рассмотрены методы, основанные на поглощении и рассеянии света, а также теневые и дифракционные.
Содержание кислорода, углекислого газа, окиси углерода и других веществ, включая различные продукты метаболизма (мочевина, глюкоза, этиловый спирт, полипептиды и пр.), растворенных в крови человека, является важнейшей информацией о жизненно важных процессах, происходящих в организме. Измерение степени насыщения крови кислородом основано на значительных изменениях в спектрах поглощения насыщенной и не насыщенной кислородом крови.
Из данных табл. 1.1 вытекает, что уменьшение насыщенности крови кислородом приводит к почти трехкратному возрастанию коэффициента поглощения вблизи А=620 нм. Отсюда следует простой метод оценки содержания кислорода в крови при использовании самого доступного Не — Ne лазера с Л=632,8 нм. Однако точные измерения с погрешностью 1—5 % могут обеспечить только более сложные методики [2, 3], использующие измерение как прошедшего, так и диффузно отраженного света на нескольких длинах волн, включая изобестическую длину волны Х=805 нм, для которой коэффициенты поглощения насыщенной и не насыщенной кислородом крови совпадают (табл. 1.1).
Преимущества лазеров в полной мере раскрываются при измерении концентрации растворенных в крови газов и продуктов метаболизма непосредственно через кожу человека [П. 39]. Метод основан на том, что окись углерода, кислород, углекислый газ и разнообразные органические вещества хорошо поглощают в ИК области спектра, где работают перестраиваемые СО, С02 и инжекционные лазеры. Например, для крови с большим содержанием СО, С02 и 02 максимумы поглощения наблюдаются на длинах волн 4,3- 5,13 и 9 мкм. Для глюкозы характерные линии поглощения находятся на 2,8- 4,8 и 6,1 мкм.
Техника измерений может быть различной. Можно измерять коэффициент пропускания тонкого слоя ткани в области между большим и указательным пальцами человека, в ушной раковине и т. д. либо использовать пластинку полного внутреннего отражения, по которой пропускается свет (5 отражений) и которая прикладывается к исследуемому объекту (кожа, язык и пр.). При исследовании внутренних органов можно использовать волоконно-оптический катетер. Для определения количественного содержания указанных веществ в крови необходима предварительная калибровка устройств с помощью эталонных проб. Точность определения существенно зависит от стабильности излучения лазеров. Многие из предлагаемых устройств могут быть использованы и в лабораторной диагностике проб крови и других биологических жидкостей, например мочи.
Измерение коэффициентов отражения биотканей в процессе их коагуляции необходимо для контроля термохимических процессов в очаге коагуляции, определяющих конечный результат воздействия. Такой контроль, в частности, применяют в офтальмологии для коагуляции тканей глазного дна 14]. Обнаружено, например, сильное увеличение отражения излучения на =441,6 нм от тканей глазного дна при коагуляции сетчатки излучением аргонового лазера (514,5 нм).
Специально для медицинских применений разработаны лазерные биофотометры, предназначенные для определения отраженной, поглощенной и прошедшей энергии биотканями поверхностных и внутренних органов [П. 28, П. 37]. В сочетании с перестраиваемыми лазерами (или набором лазеров разных длин волн), волоконно-оптическими устройствами канализации излучения и обработкой результатов измерений на ЭВМ такие фотометры окажутся полезными для диагностики патологических тканей во многих разделах медицины (например, стоматологии, офтальмологии и пр.).
При исследовании оптически плотных биологических образцов единственным информативным параметром остается коэффициент диффузного отражения, который несет информацию о спектре поглощения вещества. Примерами таких исследований являются экспрессные методы анализа биологической ценности зерна различных сельскохозяйственных культур, успешно реализованные в устройствах с тепловыми источниками, в которых селекция по длинам волн осуществляется с помощью набора узкополосных фильтров [5]. Зондирование образца (целого, размолотого зерна (шрота или муки)) на характерных длинах волн в диапазоне 1,5—2,5 мкм при соответствующей калибровке и математической обработке результатов на ЭВМ позволяет определять содержание в нем белка, жира и влаги.
Калибровка, являющаяся наиболее трудоемкой частью методики, заключается в установлении корреляционной зависимости между спектром анализируемого компонента и спектром отражения целого и размолотого зерна с последующим нахождением функциональной зависимости содержания компонента, определяемого химическим путем и из спектров отражения на отдельных длинах волн. Калибровка проводится на большом массиве образцов (30—60). Типичные значения коэффициентов корреляции на рабочих длинах волн для разных культур лежат в диапазоне 0,78— 0,99. Среднеквадратическая погрешность спектрофотометрического анализа обычно составляет 10—25 % при достоверности 90—98 %. Аналогичные исследования в видимой области (410—500 нм) позволяют определять содержание каротиноидов в крупке пшеницы (среднеквадратическая погрешность 24 % при достоверности 90 %, коэффициент корреляции 0,9).
Применение лазеров в рамках рассматриваемой методики, помимо увеличения отношения сигнал/шум, должно обеспечить высокую локальность анализа, вплоть до исследования отдельного зерна и даже отдельных малых областей целого зерна, что можно использовать в селекционной работе при разбраковке семян.
