Применение спектроскопии кр в биохимических исследованиях - лазерная диагностика в биологии и медицине
6.2 Применение спектроскопии КР
в биохимических исследованиях
Изучение белков. Классическими объектами для применения спектроскопии КР к биомолекулам являются белки и их компоненты. Причем если первые КР-спектры белков были получены в конце 50-х годов с помощью ламп, то в последние два десятилетия в качестве источников возбуждения применяют исключительно лазеры.
Целью большинства исследований, проводимых методами КР, является изучение структуры молекул и изучение отдельных функциональных групп, определяющих их биохимическую активность [9, 10].
Из обычного (спонтанного) КР-спектра белка можно получить информацию о его структурных характеристиках, например о средней конформации основной полипептидной цепи [П. 8]. В частности, такая информация содержится в положении и форме контуров полос амид-1 и амид-3. Действительно, каждая амидная группа в молекуле белка имеет интенсивную линию амид-1, положение которой в спектре зависит от конформации данного участка молекулы. Большинство амидных групп в составе, например, а-спиральной конформации испытывает примерно одинаковое влияние со стороны соседних атомов и, таким образом, имеет приблизительно одинаковую частоту линии амид-1 (1645— 1657 см-1).
Амидные группы, находящиеся в составе (3-структурного фрагмента молекулы, имеют несколько отличающуюся частоту этой линии (1665—1672 см-1). Поскольку вторичная структура реальной молекулы белка сложна, то наблюдаемая в КР-спектре этого белка полоса амид-1 представляет собой суперпозицию отдельных линий.
То же относится к полосе амид-3, в которой в разной степени проявляются линии: 1260—1295 см-1 (слабая), 1230— 1240 см-1 (сильная) и 1245±3 см-1 (широкая), относящиеся соответственно ка-спиральной, (5-структурной и неупорядоченной конформациям.
Отсюда видно, что, анализируя положение максимума и форму контура полосы (например, разлагая экспериментальную полосу но спектрам отдельных структур), можно получать количественные оценки содержания отдельных типов структуры в исследуемом белке.
Обширный материал, накопленный к настоящему времени по установлению вторичной структуры различных белков, во многом основан на исследовании КР-спектров моделей полипептидов с известной структурой [9, П. 8].
Продемонстрируем возможности спектроскопии КР при исследовании конформации белков и полипептидов в водных растворах и в твердом состоянии на примере изучения структуры и взаимодействия С-протеина и миозина [11]. Эти белки с молекулярным весом 140 ООО и 460 000 соответственно выделяли из скелетных мышц кролика. Рассеяние возбуждали Аг лазером (Ji=488,0 нм), регистрацию проводили с разрешением 5 см-1.
На рис. 6.4 приведены КР-спектры С-протеина, миозина и их комплекса. Для спектра С-протеина (рис. 6.4а) характерны сильная линия амид-1 (1668 см-1) и сравнительно хорошо выраженная полоса амид-3 (1242 см-1). Такое их положение и соотношение свидетельствуют о том, что молекулы С-протеина находятся в конформациях р-структуры и статистического клубка примерно в равной пропорции.
Для миозина (рис. 6.46) характерно слабое рассеяние в области линии амид-3, в то время как колебание амид-1 проявляется сильной линией 1653 см-1. Наблюдается также значительная линия на 939 см-1, соответствующая продольным колебаниям основной полипептидной цепи молекулы. Это свидетельствует о том, что большинство молекул миозина находится в а-спиральной конформации и незначительная их часть — в |$-структур ной конформации.
При образовании комплекса миозин — С-протеин молекулы последнего присоединяются к молекуле миозина в нескольких местах, в частности в области легкой цепи меромиозина и в области субфрагмента-2 хвоста этой молекулы. Такое взаимодействие, казалось бы, могло существенно сказаться на конформациях обеих молекул. Однако анализ КР-спектра комплекса (рис. 6.4в) показывает, что конформационных изменений молекул не происходит ни в водном растворе, ни в твердом состоянии.
Рис. 6.4. КР-спектры: а — С-протеина (3 %-ный раствор), б — белка миозина (6 % в таблетке), в — комплекса миозин — С- протеин (6 % в таблетке). Измерения проводились при одинаковых условиях: в присутствии 0,09 моль КС1 и 5*10&ldquo-3моль К3РО4
<оН=7,0) [11]
Используя методы РКР, можно во многих случаях исследовать отдельные атомные группы и их функции в биомолекуле. Так, резонансный вариант АСКР использовался для изучения сложных молекул Р-каротина, витамина Bi», металлопорфирина [12]. Представляет интерес исследование взаимодействия кофермента флавинадениндинуклеотида (ФАД) с белком-ферментом глюкозоксидазой [13, 14]. Интересной особенностью проведенных экспериментов является то, что в максимум полосы поглощения ФАД попадает длина волны антистоксового сигнала, а не длина волны излучений накачки. В том же случае когда резонансной является длина волны накачки, качество полученных спектров существенно ухудшается. В работе [14] экспериментально подтверждено наличие водородной связи ФАД — фермент.
Рассмотрим более подробно пример исследования методом АСКР механизма каталитической активности белка- фермента а-химотрипсина [15—17]. Активный центр этой молекулы включает имидазольную группу остатка Гис57, связанную водородными связями с остатками Асп 102 и Сер 195, в результате чего образуется система с переносом заряда. Возможность детального описания процесса, происходящего в активном центре а-химотрипсина, предполагает наличие информации о степени протонизации группы Гис 57: процесс переноса протона в водородных связях приводит к изменению протонизации имидазольной группы, что должно найти отражение в изменении ее колебательного спектра.
Действительно, АСКР-спектры позволяют по соотношению интенсивностей определенных линий (в частности, линии 1164 см-1) получать информацию о содержании той или иной (протонированной или непротонированной) формы имидазола. Использование АСКР позволяет регистрировать линии имидазола, не проявляющиеся в спектрах спонтанного КР.
На рис. 6.5 приведена схема АСКР-спектрометра, построенного специально для исследования биомолекул, для чего в нем использованы лазеры с высокой импульсной и сравнительно низкой средней мощностью [4]. Основой спектрометра является лазер на АИГ : Nd, работающий в режиме акустооптической модуляции добротности и синхронизации мод. Выходное излучение представляет собой Цуги импульсов, следующие с частотой 5 кГц. Длительность отдельного импульса в цуге составляет 80—85 пс, импульсная мощность 0,7 МВт. Излучение задающего генератора (1060 нм) после удвоения по частоте в кристаллах LiIOs используется в «сигнальном» канале и в канале синхронной накачки лазера на красителе. Плавная перестройка длины волны генерации этого лазера производится в диапазоне 0,56—0,60 мкм, что соответствует диапазону разности частот vx—v2=950—2100 см-1. Ширина линии генерации составляет 0,5 см-1, длительность импульса 50—60 пс, импульсная мощность 20 кВт. Для уменьшения средней мощности излучения второй гармоники (530 нм), падающего на образец, из цуга выделяется одиночный импульс. При этом в «сигнальном» канале излучение имеет среднюю мощность 30—40 мВт, импульсную — 15 кВт, длительность импульса 50—60 пс.
Рис. 6.5. Блок-схема спектрометра АСКР [4]: 1 — АИГ: Nd лазер, 2 — кристаллы LiI03, 3 — камера «Агат», 4 — зеркала, 5 — лазер на красителях, 6 — схема выделения одиночного импульса, 7 — ромб Френеля, 8 — линия задержки, 9 — дихроичное зеркало, 10 — кювета, 11 — линзы, 12 — диафрагма, 13 — призма Глана, 14 — интерференционный фильтр, 15—двойной монохроматор, 16 — ФЭУ, 17 — многоканальный анализатор, 18 — модули КАМАК, 19 — графопостроитель, 20 — ЭВМ
Излучение второй гармоники vx и лазера на красителе v2 фокусируется линзой на кювету с образцом. Генерируемый антистоксов сигнал коллимируется и фокусируется линзами на входную щель монохроматора. Для подавления нерезонансного фона линейные поляризации излучений накачки vx и v2 разводятся при помощи ромба Френеля. Вращением анализатора (призмы Глана) вблизи положения максимального подавления нерезонансного сигнала добиваются существенного видоизменения спектра. Это дает возможность управлять формой спектра за счет изменения условий интерференции нерезонансной и резонансной составляющих сигнала.
Сигнал АСКР, спектрально отфильтрованный от засветок с помощью двойного монохроматора, попадает на ФЗУ, работающий в режиме счета фотонов. Далее информация накапливается в многоканальном анализаторе. Регистрация, обработка сигнала и перестройка лазера на красителе производятся при помоги микро-ЭВМ.
Осуществляя амплитудно-поляризационное подавление нерезонансного фона, с помощью описанной установки удалось, в частности, установить гидрофобность окружения имидазольного кольца в промежутке между субглобулами молекулы а-химогрипсина, где расположен ее активный центр. На рис. 6.6 приведены спектры амплитудно-поляризационной АСКР а-химотрипсина в диапазоне 960— 1060 см-1.
Рис. 6.6. АСКР-спектр водного раствора а-химотрипсина при различных углах между осью поляризационного анализатора и вектором поляризации нерезонансного сигнала <р: — 1,0° (а), 1,5° (б),
0°(в) [4]
В этом диапазоне лежат частоты колебаний, характерных для аминокислотных остатков фенилаланина (1004 см-1), триптофана (1014 см-1), а также валентных колебаний связи С—N (1033 см-1). Интересно отметить, что все шесть остатков фенилаланина, входящих в состав белка, находятся в непосредственной близости от активного центра.
Все спектры были получены при одинакозых условиях и отличаются друг от друга углом между осью поляризационного анализатора и вектором поляризации нерезонансного сигнала (<р). Помимо подавления нерезонансного фона поляризационная методика позволяет управлять формой спектра, выделяя или ослабляя в нем те или иные линии. В частности, в эксперименте выявлена линия 1010 см-1, которая совсем не проявляется в спектрах спонтанного КР. Вопрос о соответствии этой линии определенным элементам вторичной структуры белка является предметом будущего исследования.
Уникальную возможность изучать состояние отдельных атомных групп, расположенных на поверхности макромолекул, дает также спектроскопия ГКР 17, 18, 19]. За последние годы с помощью этого метода исследовано большое число белков и составляющих их аминокислот. В частности, для водорастворимых белков было показано [19], что усиление КР наблюдается только для групп атомов, которые находятся на поверхности белковой глобулы и взаимодействуют с металлом. В то же время линии амид-1 и амид-3 в спектрах ГКР не обнаруживаются. По-видимому, это связано с эффектом экранировки пептидных групп боковыми цепями аминокислотных остатков, что отдаляет их от поверхности металла и препятствует эффективному усилению соответствующих колебаний.
Возможности ГКР при изучении белков продемонстрируем на примере светочувствительного мембранного белка — бактериального родопсина (БР). Молекулы этого белка осуществляют трансмембранный перенос протонов. Для понимания молекулярного механизма функционирования БР необходимо определить топографию его хромофорного центра (положение остатка ретиналя). Метод спектроскопии ГКР был использован для установления расположения ретиналя относительно поверхности мембран [20].
При адсорбции на гидрозоле серебра пурпурная мембрана, содержащая БР, может взаимодействовать с серебром как наружной, так и внутренней стороной (рис. 6.7). Наличие в спектре полос колебаний хромофора подтверждает вывод о сближенности ретиналя с поверхностью мембраны. Отметим, что сходство спектров РКР и ГКР в области 1000—1400 см-1 свидетельствует о том, что при адсорбции белка полиеновая цепь ретиналя полностью сохраняет трансконфигурацию, характерную для БР в водной суспензии.
Изучение нуклеиновых кислот. Первый КР-спектр ДНК был получен в 1968 г. [21]. Начиная с этого момента проведено большое число исследований методом спектроскопии КР свободных оснований и нуклеотидов, комплексов их с белками [22], тяжелыми металлами и другими элементами и соединениями. Были получены КР-спектры растворов природных вирусов [23] и хромосом [24].
Рис. 6.7. РКР-спектры водной суспензии пурпурных мембран разной концентрации: а — 10_6, в — 10-7 моль/л, б — ГКР-спектр пурпурных мембран, адсорбированных на серебряном гидрозоле, концентрация 10-7 моль/л- в нижнем спектре чувствительность увеличена в два раза [20]
Возможности спектроскопии КР для исследования различных особенностей нуклеиновых кислот можно продемонстрировать экспериментом по плавлению ДНК [25]. На рис. 6.8 приведены полученные при разных температурах КР-спектры ДНК, выделенной из тимуса теленка. Так как температура плавления ДНК лежит в интервале 80— 85 °С, то по КР-спектрам можно судить, что происходит с молекулами в процессе плавления.
Изучение температурной зависимости КР-спектров помазывает, что по температурным профилям интенсивностей
Рис. 6.8. КР-спектры водного раствора ДНК, выделенной из тимуса теленка при температуре 98 (а), 84 (б) и 25 °С (в)- рН=7,0 [25)
и частотам линий разные внутримолекулярные связи можно отнести к разным категориям: 1) связи оснований, которым соответствует обратимое уменьшение интенсивностей линий, предшествующее точке плавления, т. е. определенное явление предплавления- 2) связи оснований, для которых температурная зависимость выражена слабо или вообще отсутствует- 3) дезоксирибозофосфатные связи основной цепи, для кодебаний которых характерно отсутствие температурной зависимости ниже точки плавления и сильное падение икуенсивности в этой точке.
Некоторые линии, соответствующие всем 4 основаниям (аленину (А),-тимину (Т), цитозину (С) и гуанину (G)), претерпевают постепенное возрастание в интенсивности с ростом температуры ниже точки плавления. При достижении этой точки происходит резкое увеличение интенсивности этих линий (например, линии Т 1240 см-1 на рис. 6.8). Это говорит о том, что некоторые изменения в расположении оснований относительно друг друга (вертикальный стэкинг) начинают происходить, начиная с температуры 50 °С, г. е. существенно ниже точки плавления. При достижении точки плавления молекулы ДНК меняют свою конформацию, переходя из Б-формы в форму случайно неупорядоченного клубка.
Высокочувствительным методом регистрации тонких конформационных изменений в ДНК стала спектроскопия ГКР. В частности, регистрируются тонкие эффекты дестабилизации двойной спирали ДНК, вызванные действием даже низких доз ионизирующих излучений [27] и мутагенных факторов [28].
