Диагностика на основе регистрации скоростей направленного движения - лазерная диагностика в биологии и медицине
3.4. Диагностика биологических объектов на основе регистрации скоростей направленного движения
Электрофорез. Одним из ярких примеров применения спектроскопии квазиупругого рассеяния в биологии и медицине является электрофоретическое светорассеяние (ЭФС), используемое для измерения подвижности заряженных светорассеивающих частиц в электрическом поле. В однолучевой или двухлучевой ЛДА, снабженный низкочастотной системой обработки сигнала, вставляется электрофоретическая кювета с гомогенным раствором или суспензией исследуемых частиц. Простейший тип кюветы представляет собой спектрофотометрическую ячейку, в которую вводятся близко расположенные электроды (чаще всего платиновые или палладиевые). При наложении разности потенциалов в растворе возникает направленное движение частиц со скоростью
где ц, — электрофоретическая подвижность (ЭФП), е и г) — диэлектрическая проницаемость и вязкость среды, — поверхностный потенциал частиц. Соответствующий доплеровский сдвиг частоты согласно формулам (3.1) и (3.3)
(3.5)
Следовательно, зная напряженность поля в кювете и измерив доплеровский сдвиг частоты, можно прямо определить ЭФП и из нее — поверхностный потенциал частиц. Наглядную информацию об ЭФС несут доплеровские спектры. На рис. 3.7 представлен доплеровский спектр, полученный с помощью однолучевого ЛДА (угол рассеяния 0=11,7°) от популяции форменных элементов крови — сме-
Рис. 3.7. Спектр ЭФС, полученный от суспензии лимфоцитов (1) и эритроцитов (2)
си лимфоцитов и эритроцитов в буферном растворе [33]. Амплитуда доплеровских пиков пропорциональна концентрации клеток, которые, как видно, хорошо различаются в этом эксперименте. Если в соответствии с выражением (3.5) пересчитать доплеровские частоты в подвижность, то можно построить спектры ЭФП в соответствующих единицах. Пример спектров ЭФП тромбоцитов и эритроцитов человека показан на рис. 3.8 [34].
Рис. 3.8. Спектры ЭФП тромбоцитов (1) и эритроцитов (2) человека
Широкое распространение ЭФС в биологии и медицине как высокочувствительного и оперативного аналитического метода определяется большим разнообразием частиц, которые могут быть исследованы: от субмикронных макромолекул до крупных эукариотических клеток, а также широким спектром решаемых задач. Это и анализ состава смеси частиц (форменных элементов и белков плазмы крови, популяций вирусов и бактерий и т. д.), и анализ иммунологических реакций, проводимый при диагностике заболеваний, связанных с изменением иммунного статуса организма (появлением злокачественных опухолей, иммунодефицитного состояния и т. д.). ЭФС используется для изучения процессов агрегации и полимеризации белковых молекул (например, переходов тетрамер — димер гемоглобина), наблюдаемых при высоких значениях pH, самосборки актиновых филаментов (F-актина) из глобулярных мономеров (G-актина).
На рис. 3.9 изображены три спектра ЭФС актина в растворе с разным содержанием ионов Mg2.+ [35]. Спектр, изображенный на рис. 3.9а, получен при угле рассеяния 9° в растворе 8,3 ммоль G-актина при температуре 20 °С и напряженности электрического поля 104 В/см. Характерно, что спектр содержит один узкий пик, ширина которого определяется диффузией мономеров G-актина (аппаратное уширение в этом случае существенно меньше). Доплеровский сдвиг на 139 Гц соответствует ЭФП ц=2,4 см2/(В-с) в стандартном стабилизирующем буфере.
Рис. 3.9. Три спектра ЭФС, полученные от раствора белка актина с разным содержанием ионов магния
Следующий спектр (рис. 3.96) получен через 30 минут после добавления в раствор MgCl2 с соответствующим повышением концентрации Mg2+ до 0,5 ммоль. Видно, что это приводит к образованию частиц с меньшей ЭФП и к расширению диапазона значений ЭФП. С течением времени спектр приобретает вид двух узких пиков, соответствующих меньшим частотным сдвигам. Спектр, изображенный на рис. 3.9в, получен через 12 часов после первого. Правый пик дают медленно движущиеся филаменты F-актина. Левый пик можно отнести к актиновым филаментам, прикрепляющимся к стенкам кюветы.
Методом лазерного ЭФС в настоящее время пользуются во многих лабораториях медико-биологического профиля.
Специфические трудности применения этого метода, связанные с нагреванием раствора, с необходимостью учета электроосмотических явлений и ряда других, уже частично преодолены. Исследования, направленные на совершенствование метода и на расширение сферы его применений» продолжаются.
Гемодинамика. Другим направлением работ, связанных с регистрацией направленного движения частиц в медицинской диагностике, является измерение скоростных характеристик потоков крови: средней интенсивности кровотока, распределения скоростей по сечению сосуда, интенсивности турбулентных пульсаций и пр. Эти работы важны для развития исследований по физиологии и реологии крови и кровеносных сосудов в связи с задачами создания их искусственных заменителей и с задачами диагностики заболеваний. ЛДА находит в этих работах все большее применение [36].
Первые измерения скорости кровотока in vivo с помощью ЛДА были проведены в начале 70-х годов на артериях сетчатки глаза кролика [37]. Экспериментальная установка позволила оценить скорость кровотока, которая оказалась порядка 1,1—1,8 см/с, что находится в хорошем соответствии с результатами, полученными традиционными методами. Однако необходимость сравнительно большого уровня мощности лазерного излучения (около 10 мВт) при длительности измерений около 2 минут, а также анестезирования и расширения зрачка не позволили сразу использовать этот метод в клинической практике и потребовали его значительной модернизации [38—40].
Для получения значений скоростей кровотока и упрощения юстировки системы стали использовать схемы с опорным пучком. Конструктивно все элементы оптической схемы располагают в модернизированной фундус-камере, что позволяет проводить независимые измерения скорости кровотока с использованием обычной флуоресцентной ангиографии при экспериментальных исследованиях. Подобным системам присущ общий недостаток: смещение кровеносного сосуда от точки фокусировки во время измерений. Поэтому обычно стараются или сократить время измерения до 0,5 с и менее [40], или использовать специальные компенсационные схемы, позволяющие в автоматическом режиме следить за положением лучей на кровеносном сосуде с их последующей корректировкой [41].
В офтальмологии ЛДА может с успехом использоваться для изучения относительной закупорки вен и артериальной недостаточности при заболеваниях сосудов сетчатки, влияния фотокоагуляции на сосудистую циркуляцию и для других диагностических целей.
Необходимо заметить, что точность измерения скорости кровотока достаточно высока только в случае очень тонких
Рис. 3.10. Доплеровские спектры, полученные от потока разбавленной (/) и цельной (2) крови в стеклянном капилляре
капилляров диаметром менее 100 мкм, имеющих прозрачные стенки, когда выполняется условие однократного рассеяния. В более крупных капиллярах начинают сказываться эффекты многократного рассеяния [42].
На рис. 3.10 показан характерный вид доплеровских спектров, зарегистрированных с помощью дифференциального ЛДА в модельном эксперименте на стеклянном капилляре диаметром 210 мкм, по которому с одной и той же скоростью, оцененной по объемному расходу, протекала разбавленная (/) и цельная (2) кровь. Разбавление было таким, что обеспечивался режим однократного рассеяния. Обращает на себя внимание асимметричная форма спектра во втором случае. Однако, несмотря на многократное рассеяние, доплеровский спектр от цельной крови содержит хорошо выраженный максимум, по которому, вообще говоря, можно судить о скорости течения. Это объясняется тем, что эритроциты, вносящие основной вклад в рассеяние, по своим размерам более чем на порядок превышают длину волны излучения лазера, и их индикатриса рассеяния резко вытянута вперед. Однако многократное рассеяние приводит к смещению спектра. Если не учитывать это смещение при измерениях, то можно получить искаженные результаты [36].
Большая объемная концентрация эритроцитов в цельной крови и наличие непрозрачных стенок у крупных одиночных сосудов делают невозможными невозмущающие оптические измерения скорости in vivo. Поэтому в таких случаях излучение вводят внутрь сосуда с помощью волоконно-оптических катетеров диаметром 100—500 мкм [43, 44]. Эти же катетеры служат и для выведения рассеянного излучения из потока. При этом основной вклад в регистрируемый сигнал вносят эритроциты, движущиеся вблизи торца световода, что дает пространственное разрешение измерений около 100 мкм. Очевидным недостатком такого метода измерений является возмущение потока, так что реально измеряется не истинная скорость, а скорость обтекания. Ее отклонение от истинного значения зависит от относительных размеров световода и сосуда, а также от формы торца световода. Тем не менее подобные системы успешно применяются для измерения не только стационарных, но и пульсирующих потоков [45].
Диагностику ряда сердечно-сосудистых, эндокринных, кожных и других заболеваний можно проводить, измеряя нарушения микроциркуляции — кровотока в микрососудах приповерхностного слоя органов. Такие измерения можно проводить бесконтактно, регистрируя свет, рассеянный на эритроцитах, которые движутся в разных направлениях в слое ткани толщиной 0,5—2 мм [46, 47]. В зондируемой лазерным пучком области имеются капилляры, ориентированные в разных направлениях и имеющие, следовательно, различные проекции на вектор рассеяния. Поэтому сигнал, возникающий в результате оптического смешения света, рассеянного на движущихся эритроцитах и на относительно неподвижных тканях, имеет характерный низкочастотный спектр, центрированный около нулевой частоты, без выраженных максимумов. Полуширина такого спектра, как было показано в модельных экспериментах [46], пропорциональна интенсивности микроциркуляции в исследуемой области.
К настоящему времени разработано несколько модификаций фотон-корреляционных волоконно-оптических измерителей микроциркуляции, применение которых в условиях клиники показало их высокую эффективность [47, 48]. Разрабатываются также действующие по такому же принципу компактные приборы, использующие в качестве излучателя малогабаритные диодные лазеры, интегрированные в один блок с детекторами [49].
