Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих процессов - лазерная диагностика в биологии и медицине

Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих
процессов
Методы ультрабыстрой лазерной спектроскопии позволяют проводить исследования динамики внутреннего движения биомолекул. Во многом именно потребности исследований структурной динамики биомолекул стимулировали развитие пико- и субпикосекундной спектроскопии, в том числе и абсорбционной спектроскопии быстропротекающих процессов [П. 1 — П.З]. С помощью этих методов исследуются сверхбыстрые процессы колебательного и электронного возбуждения биомолекул, а также динамика химических реакций с их участием.
Абсорбционные методы позволяют определять полное время релаксации биомолекул в основное состояние, время их колебательной релаксации, скорость передачи возбуждения в смеси биомолекул, скорость передачи заряда между биомолекулами в смеси акцепторов и доноров, динамику фотодиссоциации биомолекул в растворе, скорость конформационных изменений и пр. Исследуются первичные процессы фотосинтеза организмов — пурпурных и зеленых бактерий- динамика фотосистем I и II в зеленых растениях и водорослях- первичные стадии преобразования энергии света родопсинами при изучении фотохимии зрения и биоэнергетики галофильных бактерий (бактериородопсин)- фотообратимые фотохромные пигменты (фитохром), выполняющие биорегуляторные функции в клетках многих простейших и растений- динамика фотодиссоциации гемопротеинов (гемоглобина и миоглобина) и др. Характерные времена рассматриваемых процессов лежат в довольно широком диапазоне: 0,6—200 пс, требуемый диапазон длин волн лазерного излучения для их исследования составляет 460—880 нм.
Основная идея абсорбционной спектроскопии с использованием сверхкоротких импульсов заключается в том, чтобы «уйти» от прямых измерений длительности импульса, прошедшего поглощающую среду. Поэтому применяют два последовательных световых импульса, первый из которых переводит биомолекулы из основного в возбужденное состояние, а второй, задержанный на пико- или субпикосекундный интервал времени, так называемый измерительный импульс, регистрирует изменение спектра поглощения исследуемого объекта. В данном случае инерционный фотодетектор фиксирует те изменения в спектре поглощения, которые произошли за время, определяемое временной задержкой.
Возможны самые разнообразные схемы, реализующие эту идею, см., например, [П. 1 — П. 3, 1.35]. При этом возбуждающий и пробный импульсы могут иметь одинаковые и разные длины волн, возбуждающий и зондирующий лазерные пучки могут быть взаимно перпендикулярны и почти коллинеарны, в качестве регистрирующего элемента могут быть использованы: фотопленка, фотодиодные матрицы, видеокамеры, оптические многоканальные анализаторы, и отдельные фотодетекторы. Могут быть реализованы схемы с одиночными возбуждающим и пробными импульсами и с многократным их повторением, с широким спектром зондирующего излучения и пр.
При исследованиях скоростей ориентационной и вращательной релаксации, а также скорости передачи электронной энергии молекул в жидкостях используется одна из модификаций метода, которая основана на анализе наведенной поляризованным возбуждающим импульсом анизотропии в среде с помощью измерения поглощения пробного импульса для различных взаимных ориентаций поляризации возбуждающего и пробного импульсов [П. 1].
Наибольшее распространение при изучении фотохимических процессов перестройки структуры биомолекул получил так называемый метод дифференциальной абсорбционной спектроскопии, который основан на регистрации дифференциальных спектров поглощения, представляющих собой разность между спектрами поглощения до возбуждения и спектрами, зарегистрированными в различные промежутки времени после возбуждения. Изменение оптической плотности исследуемого объекта ДD(k, t) определятся соотношением [6, 7]
где Ё=Еа!Еоа и Ёй~Е°п/Е1п — отношение энергий пробного и опорного импульсов, прошедших через исследуемый образец при возбуждении и без возбуждения.

Рис. 5.3. Схема пикосекундного абсорбционного спектрометра на базе параметрических генераторов света [7]

Рис. 5.2. Принципиальная схема субпикосекундного абсорбционного спектрометра [61
В качестве примера на рис. 5.2 и 5.3 представлены схемы двух типичных субпико- и пикосекундных абсорбционных спектрометров, реализующих дифференциальную методику, измерения спектров поглощения, почти коллинеарное распространение возбуждающего и пробного световых пучков, переменную оптическую линию задержки импульсов.
В первой схеме импульс света гигаваттной мощности длительностью т&bdquo-=100 фс на длине волны Х=615 нм делится между каналами возбуждения и зондирования. В канале возбуждения импульс через оптическую линию задержки /, нейтральный светофильтр 2 попадает на образец 3 и далее на монохроматор 4. В канале зондирования происходит преобразование излучения в субпикосекундный континуум (ВКР преобразование в сантиметровой кювете с водой, 5, 6 — красные светофильтры). Этот пучок далее делится на два: пробный и опорный. Пробный совмещается с возбуждающим пучком, а опорный после фильтрации с помощью сине-зеленого светофильтра 7 используется для получения информации о спектре поглощения среды в отсутствие возбуждения. Изменение временной задержки импульсов позволяет изучать кинетику процессов, а перестройка монохроматора — изменения в спектре наведенного поглощения на выбранных длинах волн. Сигналы после монохроматора принимаются фотоприемниками 8, 9, оцифровываются с помощью цифровых вольтметров 10 и вводятся через интерфейс 11 в управляющую ЭВМ 12, которая осуществляет накопление данных по многим лазерным вспышкам, их усреднение и вычисление среднеквадратической погрешности, а также управление работой всего спектрометра.
Вторая схема построена на основе параметрических генераторов света (ПГС), отличается высокой степенью автоматизации измерений и обработки данных (рис. 5.3). Это позволяет проводить исследования широкого класса биообъектов с малой погрешностью измерения оптической плотности, вплоть до 2-10-4. Источником накачки является АИГ : Nd лазер 1 с системой выделения моноимпульса 2 и усилителем 3, что определяет высокую надежность и стабильность работы спектрометра. Возможна замена задающего лазера на лазерную систему на фосфатном стекле, что позволяет на порядок увеличить временное разрешение спектрометра. Источником возбуждающего излучения является пикосекундный ПГС на кристалле KDP 5, накачиваемый второй гармоникой лазера на АИГ : Nd. При использовании удвоителя и сумматора частот 4 такая система позволяет перекрывать довольно широкий диапазон от 330 до 1400 нм и получать довольно значительный уровень энергии ^0,1 мДж.
В канале зондирования можно использовать два источника света: ПГС — на кристалле LiNb03 6 с удвоителем частоты или источник пикосекундного континуума (ВКР преобразователь на тяжелой воде 7). При измерениях кинетических характеристик поглощения в отдельных участках спектра применение ПГС дает возможность повысить надежность и расширить диапазон измерений за счет высокой стабильности энергетических,, спектральных и временных характеристик, широкого диапазона длин волн, включая УФ и ИК области спектра, высокой спектральной яркости и монохроматичности излучения. Последнее позволяет работать без монохроматора и использовать фотодиоды для регистрации сигнала. При снятии дифференциальных спектров нестационарного поглощения более удобным оказывается ВКР преобразователь на D20 в сочетании с перестраиваемым монохроматором 12. Неназванные параметры схемы на рис. 5.3: 8 — оптическая линия задержки, .9 — биообъект, 10 — фотодатчик, 11 — электромагнитный затвор, 13 — автоматизированная система управления спектрометром.
Принципиальным является тот факт, что импульсы, получаемые от ПГС, имеют более крутые фронты, чем импульсы лазеров с синхронизацией мод. Это позволяет увеличить временное разрешение за счет уменьшения временной области перекрытия возбуждающего и зондирующего импульсов. Рассматриваемый спектрометр допускает применение схемы с зондированием во встречном направлении по отношению к пучку возбуждения, что дает возможность значительно снизить попадание рассеянного света возбуждающего пучка в канал зондирования. Эта возможность особенно важна при исследованиях сильно рассеивающих биологических объектов.
Для более детального ознакомления с методами лазерной пико- и субпикосекундной абсорбционной спектроскопии биомолекул, с лазерными спектрометрами сверхвысокого временного разрешения, а также с конкретными исследованиями динамики биомолекул можно рекомендовать литературу, вышедшую в последние годы [П. 1 — П. 3,
1.35].