Стахиботриотоксикоз - токсинобразующие микроскопические грибы
Stachybotrys С о г d а — стахиботрис
Стахиботриотоксикоз (Stachybotryotoxicosis)
Stachybotrys alternans В о п о г d — стахиботрис чередующийся
Вызывает широко распространенное заболевание лошадей, крупного рогатого скота и других видов животных. Впервые этиологическое значение гриба в заболевании лошадей было установлено в 1938 г. коллективом ученых Института микробиологии Академии наук УССР под руководством В. Г. Дроботько (1946, 1949). Заболевание получило название стахиботриотоксикоза.
Еще до выяснения этиологического значения Stachybotrys alternaqs Пономаренко (цит. по Дроботько и др., 1949) изучены клинические и патологоанатомические признаки заболевания и установлена принадлежность его к отдельной нозологической единице, не известной до того времени в науке.
Заболевание стахиботриотоксикозом отмечалось также на Украине в 1931 г. В 1937—1940 гг. наблюдалось в районах Поволжья
Восточной Сибири, центральной полосы СССР, Молдавии, Румынии, Польше, Словакии, Венгрии (Саркисов, 1954).
Стахиботриотоксикоз возникает алиментарным путем при употреблении кормов, пораженных St. alternans, характеризуется тяжелыми воспалительными и некротическими процессами слизистых пищеварительного тракта, геморрагическим диатезом, развитием лейкопении и агранулоцитоза. Заболевание протекает в типичной и атипичной формах. При типичном течении различают три стадии стахиботриотоксикоза, наступающие последовательно одна за другой.
Первая стадия наступает обычно через один — три дня поедания корма, пораженного St. alternans- характеризуется гиперемией и изъязвлением слизистых оболочек ротовой полости, инфильтрацией подчелюстных лимфатических желез, воспалением слизистой носа и конъюнктивитом, более или менее выраженным припуханием губ, с последующим шелушением некротизированных слоев эпидермиса и появлением трещин на губах возле углов рта. Иногда наблюдается повышение температуры. Эти поверхностные поражения обычно заживают на пятые — восьмые сутки, оставляя на местах некроза рубцы. Вначале отмечается лейкоцитоз с нейтрофилией. В зависимости от токсичности гриба первая стадия может протекать в течение 10—15 дней (реже — дольше). При замене ядовитого корма на доброкачественный заболевание проходит быстро.
Вторая стадия наступает после более длительного скармливания пораженного грибом корма, также в зависимости от количества последнего и степени его токсичности- продолжается от 8 до 40 дней (обычно 15—20). В этой стадии наблюдаются типичные для стахиботриотоксикоза изменения: агранулоцитоз, лимфоцитоз- первичный нейтральный лейкоцитоз сменяется стойкой лейкопенией- тромбопения, понижение ретракции кровяного сгустка. Содержание тромбоцитов снижается до 28—18 на 3000 эритроцитов, число лейкоцитов достигает 4—1 тыс. в 1 мм3 крови. Наступают резкие изменения некоторых биохимических показателей крови — уменьшение содержания в крови неорганического фосфора, ацитоз. По состоянию больного животного эту стадию многие авторы считают «скрытым» периодом, хотя она характеризуется прогрессирующими и тяжелыми изменениями организма: геморрагическим диатезом, нарушением работы желудочно-кишечного тракта, вторичными некрозами слизистых ротовой полости, повышением температуры и др. При замене корма на доброкачественный и лечении возможно выздоровление.
Третья стадия характеризуется резким подъемом температуры до 39—40° С и выше, ослаблением сердечной деятельности, прогрессирующей общей слабостью, угнетением и резкими изменениями в крови, проявляющимися в дальнейшем нарастании тромбопении до 8 тыс. на 2000—3000 эритроцитов, снижении или полном исчезновении ретракции крови (часто за несколько часов до гибели кровь теряет способность свертываться) и сильно выраженной лейкопении (количество лейкоцитов уменьшается до 200 в 1 мм3 крови)- прогрессируют некротические процессы, в ротовой полости возникают обширные ареактивные очаги. Течение заболевания усложняется вторичной бактериальной инфекцией, вызванной вискозной палочкой, диплострептококком или гемолитическим стрептококком- обычно заканчивается гибелью животного, в редких случаях выздоровления кровь возвращается к норме только через 20—30 суток.
Атипичная, или шоковая, форма стахиботриотоксикоза отмечается при скармливании большого количества остротоксического корма и развивается очень быстро — через 5—10 ч. Характеризуется резким повышением температуры, расстройством сердечно-сосудистой системы, явлениями нарастающего отека легких, симптомами со стороны центральной нервной системы, множественными кровоизлияниями слизистой ротовой и носовой полостей. Возникает тромболейкоцитоз, свертываемость крови иногда повышается. Исход обычно летальный.
В 1937—1938 гг. Линник впервые установил заболевание стахиботриотоксикозом людей, имеющих контакт с пораженными St. alternans кормами. Симптомы: раздражение слизистых оболочек глаз, носа, рта, зева, бронхов (иногда с кровотечениями), а также кожи, особенно в области потоотделительных желез. Пораженные участки слизистой или кожи остроболезненны, с сильным зудом и жжением. Карпова-Бенуа (1954) и Самсоновы (1960) обнаружили случаи заболевания людей при контакте с целлюлозосодержащим сырьем, пораженным St. alternans.
Самсоновы установили заболевание людей при попадании конидий и фрагментов мицелия гриба в организм респираторным путем. В опытах на лабораторных животных отмечены патологоанатомические изменения отдельных органов при пневмостахиботриотоксикозе.
Наиболее характерными патологоанатомическими изменениями при стахиботриотоксикозе являются следующие: более или менее остро выраженный геморрагический диатез, проявляющийся в виде множественных точечных, полосатых, пятнистых, диффузных кровоизлияний, геморрагические воспаления лимфатических узлов головы и шеи, некротические изъязвления слизистой рта, глотки, миндалин, десен, реже пищевода и тонких кишок, чаще желудка и особенно толстых кишок- в печени иногда отмечаются некротические очаги и кровоизлияния, слабо выраженные явления белково-жировой дистрофии- нередко разжижение костного мозга с очаговыми кровоизлияниями, отеки в легких. Патологоанатомическая картина стахиботриотоксикоза лошадей изучалась Вертинским (1941), Языковой (1944), Пономаренко (цит. по Дроботько и др., 1949), Мельниченко (1949) и др.
Аскалонов (1949) исследовал токсичность St. alternans для других видов животных: крупного и мелкого рогатого скота, мелких домашних и лабораторных животных, птицы. Согласно данным автора, при экспериментальном стахиботриотоксикозе у крупного рогатого скота вызывается заболевание в менее сильной степени. Более высокая чувствительность выявилась у собак и кошек: однократный прием культуры гриба с пищей вызывал гибель у первых через 3— 5 дней, у вторых — через 1—2 дня. Чувствительны к токсину морские свинки, белые крысы, мыши, а также куры и голуби. Заболевание у животных протекает при характерных клинических и патологоанатомических признаках.
Впоследствии рядом авторов изучался стахиботриотоксикоз крупного рогатого скота (Фортушный и др., 1959- Курманов, 1961- Мешков, 1961- Спесивцева, 1961- Пономаренко, 1962- Измайлов, 1964, и др.). Заболевание в острой форме длится от 3 до 10 дней и заканчивается обычно летальным исходом. У коров, как правило, сразу снижаются удои молока и в дальнейшем развиваются типичные клинические признаки, в основном такие же, как у больных стахиботриотоксикозом лошадей. Однако у крупного рогатого скота чаще и интенсивнее образуются отеки и водянки, отсутствуют или редко возникают некрозы губ и ротовой полости, миндалин, но отмечаются обширные некротические очаги на слизистой преджелудка, некрозы печени, бактериальная эмболия, тканевой микробиоз и др. (Пономаренко, 1962).
Течение заболевания и проявление его форм в значительной степени зависят от дозы или токсичности корма. Последняя определяется как степенью его поражения, так и, особенно, токсичностью гриба. Это было показано впервые при изучении этиологии стахиботриотоксикоза. Опыты проводились на шести лошадях, получавших культуру гриба соответственно из 30, 20, 10, 5, 3 и 1 чашек Петри. Первая лошадь погибла на 5-е, вторая — на 9-е, третья — на 32-е сутки, остальные две заболели на третий месяц. У первых двух при вскрытии отмечена резко выраженная жировая инфильтрация клеток печени, у третьей, получавшей гриб из 10 чашек Петри, проявились наиболее типичные патологоанатомические признаки стахиботриотоксикоза, у четвертой наблюдалась резко выраженная лейкопения, а у лошадей, получавших гриб из трех и одной чашек Петри, только к концу опыта (через 3 месяца) отмечено воспаление слизистой губ и ротовой полости (Дроботько и др., 1949). Многие авторы отмечают различную токсичность штаммов St. alternans, выделенных из пораженного корма (остротоксические, слаботоксические и атоксические). Пидопличко (1949) показал, что штаммы St. alternans, выделенные из кормов, вызывавших стахиботриотоксикоз у лошадей в 1937—1938 гг. на Украине и в Крыму, обладали в разной степени токсическими свойствами- в то же время штаммы, выделенные из кормов Башкирии, были атоксичны. Саркисов (1954) указывает, что из образцов кормов, вызывавших заболевания лошадей, обычно выделялись токсические штаммы гриба, а в местах, где стахиботриотоксикоз не наблюдался, как правило, выделялись атоксичные штаммы. 
Рис. 32. Снижение количества тромбоцитов в крови разных лошадей, больных стахиботриотоксикозом (с летальным исходом).
По данным автора, токсин в малых дозах обладал замедленным и резорбтивным действием, но течение заболевания можно было значительно ускорить однократным введением дозы, способной вызвать необратимые нарушения. Например, при поедании 20—30 г соломы, зараженной остротоксичной культурой St. alternans, у животных в течение 10—14 суток возникает типичная форма заболевания, а однократное использование этого количества корма вызывает острую форму заболевания с характерными для типичного стахиботриотоксикоза признаками (рис. 32, 33).
Рис. 33. Снижение резервной щелочности крови разных лошадей, больных стахиботриотоксикозом (с летальным исходом).
По данным Бакай (1956), из 23 исследованных штаммов St. alternans, выделенных из токсических кормов, только четыре были нетоксичными. Шулюмова и сотрудники (1956) также отмечали, что в условиях юга Украины токсичность штаммов изменчива: различны форма проявления, динамика развития и продолжительность энзоотии стахиботриотоксикоза. При высокой степени поражения корма токсической расой St. alternans энзоотия начинается быстро и проявляется в тяжелой форме- при незначительном поражении корма или низкой токсичности расы St. alternans количество больных животных увеличивается постепенно, и заболевание протекает в слабой форме. Авторы считают, что установленные стадии в течении стахиботриотоксикоза могут изменяться в зависимости от степени пораженности корма и токсичности гриба. Очевидно также, что в отдельных случаях, как и при других микотоксикозах, хронические формы стахиботриотоксикоза, обусловленные слаботоксическими штаммами St. alternans, проходят незамеченными или неправильно диагностируемыми.
Американские ученые (Forgacs и др., 1958), изучавшие токсические для животных свойства St. atra (St. alternans), получили данные, согласующиеся с данными, установленными советскими исследователями.
Различная токсичность штаммов наблюдается при культивиро-
вании. Из 40 штаммов St. alternans культуральная жидкость 26 штаммов вызывала кожную реакцию у кроликов, 15 штаммов были слаботоксичны (Forgacs, 1962). По данным Юськива (1968а, 19686), изучавшего токсические свойства 21 штамма St. alternans, выделенного из почвы и пораженных кормов, положительная проба на коже выявлена у пяти штаммов, положительная реакция с резорцином— у 13, и все оказались токсичными в алиментарных опытах. На 5—8-й день мыши погибли от корма, зараженного 16 штаммами, на 10—14-й день — от корма, зараженного остальными шестью штаммами.
Токсин St. alternans растворяется в ряде органических растворителей. Эфирные экстракты из культуры гриба или пораженных кормов проявляют некротическое действие на кожу животных и вызывают при соответствующих дозах экспериментальный стахиботриотоксикоз у лошадей и других животных. На основании кожной реакции кроликов на действие эфирных экстрактов из гриба или из пораженных им кормов, впервые примененной при изучении этиологии заболевания, создан метод «кожной пробы» для определения токсичности кормов и грибов, который сейчас широко используется советскими и зарубежными специалистами.
Как уже упоминалось, St. alternans встречается в почве и целлюлозосодержащих субстратах. Гриб значительно распространен в природе в различных географических зонах, в почве и на растительных остатках, органах растений, а также как вредитель целлюлозной промышленности, изделий и книжных фондов (Bisby, 1945- Пидопличко, 1949, 1954- Билай, Пидопличко, 1968, и др.).
Виды рода Stachybotrys, как и многие целлюлозоразрушающие грибы, по-видимому, играют роль в обогащении почвы легкоусваиваемыми органическими веществами, способствуя развитию других микроорганизмов. Возможно, St. alternans имеет некоторое фитопатологическое значение при поражении волокна нераскрывшихся коробочек хлопчатника, стеблей сахарного тростника и фруктовых деревьев. Изучение токсических свойств и географического происхождения рас St. alternans представляется весьма важным для понимания процессов токсинобразования и их значения в возникновении заболеваний сельскохозяйственных животных и человека.
Фармакологические свойства спиртовых растворов токсинов St. alternans из эфирных экстрактов пораженного корма или культуры гриба на сусловом агаре изучали Серебряная (1949), Прокопович (1949) и др. Действие токсина на изолированное сердце лягушки вызывало сравнительно быстрый систолический подъем амплитуды сокращений с уменьшением диастолического расслабления. При более высоких концентрациях токсина остановка деятельности сердца наступала также в систоле- примерно в четыре раза меньшая концентрация токсина по сравнению с концентрацией, действующей на изолированное сердце лягушки, вызывала после кратковременного расширения стойкое сужение сосудов изолированного уха кролика (по Кравкову — Писемскому) (рис. 34). По данным Прокоповича, изучавшего фармакологические свойства более очищенного токсина St. alternans, высокие концентрации вызывают быстрое укорочение диастолы, аритмию и остановку изолированного сердца лягушки в систоле, более низкие — увеличение систолы и диастолы, а также замедление ритма сокращенияПри патологоанатомическом исследовании погибших мышей, которым вводился токсин, обнаружена систолическая остановка желудочков сердца.
Рис. 35. Снижение максимального и минимального артериального давления при экспериментальном стахиботриотоксикозе крупного рогатого скота.
Рис. 34. Влияние стахиботриотоксина на сосуды изолированного уха кролика (по Кравкову— Писемскому):
1 — расширение на 13%, 2 — норма 100%, 3 — сужение на 33%.
Очень высокие концентрации токсина не вызывали гемолиза отмытых эритроцитов крови кролика, в то время как промежуточные концентрации вызывали их полный гемолиз- добавление холестерина не снимало гемолитического действия токсина. Установлено, что только водонерастворимая часть токсина (осаждаемая водой из спиртового раствора) вызывает дигисталикоподобное действие на изолированное сердце лягушки, гемолиз и оказывает токсическое действие на организм.
При стахиботриотоксикозе у лошадей и крупного рогатого скота наблюдается снижение кровяного давления, возникающее в результате длительного употребления животными токсического корма. Считают, что в механизме снижения кровяного давления участвуют периферические кровеносные сосуды, которые реагируют на токсин резким расширением в результате возбуждающего действия стахиботриотоксина на парасимпатическую нервную систему. С другой стороны, ускорение седиментации эритроцитов и лейкопения, наблюдаемые при стахиботриотоксикозе, могут возникать из-за действия токсина на симпатическую нервную систему (рис. 35) (Ярослав, 1952- Саркисов, 1954- Борисевич, 1962, и др.).
Антонец (1962) изучал изменение электрокардиограммы у клинически больных стахиботриотоксикозом крупного рогатого скота и
экспериментальных животных. Первые изменения связаны с нарушением ритма, изменением зубцов и интервалов. Они аналогичны изменениям, вызываемым ваготропными сердечными ядами типа наперстянки. Возникает различная степень нарушения проводимости — от незначительного угнетения до брадикардии,— блокада и мерцание предсердий. В дальнейшем отмечаются признаки тяжелых морфологических изменений миокарда- общее снижение вольтажа, удлинение и деформация начальной и конечной частей желудочкового комплекса, резкое увеличение систолического показателя, экстрасистолия, электрическая альтернация и фибрилляция предсердий.
Рис.36. Повышение содержания сахара в крови при экспериментальном стахиботриотоксикозе крупного рогатого скота.
У животных, больных стахиботриотоксикозом, снижаются восстановительная щелочность крови и количество неорганического фосфора, замедляется или отсутствует ретракция кровяного сгустка (в связи с уменьшением содержания тромбоцитов) (Саркисов, 1954).
В моче больных коров обнаруживаются белок, желтые пигменты, в осадке — большое количество лейкоцитов и клеток почечного эпителия. Отмечены изменения в составе фракций белков крови: уменьшение количества альбуминов, увеличение содержания а1=а2 = (в1-глобулинов, появление и увеличение содержания фракции Уз-глобулинов. Значительно изменяется электрофоретическая подвижность отдельных фракций белков крови, что проявляется раньше клинических признаков заболевания (Измайлов, 1962, 1964).
Резкая гипергликемия отмечена при экспериментальном стахиботриотоксикозе крупного рогатого скота, что свидетельствует о торможении метаболизма глюкозы в печени и тканях (рис. 36) (Борисевич, 1962).
Токсины St. alternans являются характерными метаболитами гриба. Как при поражении природных субстратов, так и при культивировании наличие токсина отмечается в конидиях, стеригмах, фрагментах мицелия и культивируемой среде. Первоначальные исследования токсинобразования проведены при культивировании St. alternans на соломе или зерне овса, сусловом агаре. Впоследствии ряд авторов изучал влияние условий культивирования на рост и токсинобразование гриба. Работа Перльман (Parlmann, 1948) является одной из первых по изучению влияния отдельных компонентов углеродного, азотного и минерального питания на рост Memnoniella echinata и St. alternans (St. atra), хотя она и не связана с исследованием токсинобразования. Из опытов следует, что пригодными источниками углерода* были крахмал (3,4), декстрин (2,8), ксилоза (2,9), фруктоза (2,2), глюкоза (2,0), лактоза (2,4), мальтоза, сахароза, целлобиоза (по 2,1), арабиноза (2,1), винная кислота (2,0), эритрит (2,1), галактоза (2,1), манноза, маннит (1,8), рафиноза (2,0), глицерин (1,7), дульцит (1,3), в-метил-глюкозид (1,3), салицин (1,0), трегалоза (0,9), сорбит (1,0).
Менее интенсивный рост мицелия отмечен при росте гриба на средах с солями натрия, муравьиной, уксусной, пропионовой, щавелевой, лимонной кислот, слабый рост — при использовании этанола, инозита, сорбозы, инулина. Отсутствовал рост гриба на средах с метаном, пропаном, изопропаном, н-бутанолом, этилацетатом, амилацетатом. При использовании поли- и дисахаридов наблюдалась высокая степень их гидролиза: в культурах пятидневного роста лактоза, сахароза, мальтоза, салицин гидролизовались на 100%, рафиноза, целлобиозана 70—80, крахмал — на 40, а а-метилглюкозид, трегалоза — соответственно на 15 и 25%. Перльман считает, что ассимиляция углеводов происходит преимущественно путем их полного окисления до углекислоты и воды. Из исследованных источников азота хороший рост гриба отмечен при использовании нитратного азота (2 мг/мл), аммония фосфорнокислого (2,4 мг/мл), мочевины (2,5 мг/мл), глицина (2,3 мг/мл), пролина (2,3 мг/мл), гистидина (2,5 мг/мл). Менее интенсивно использовались тимин и креатин. Не использовались в качестве источников азота KCN, никотиновая кислота, рибофлавин, индол, индолуксусная кислота, стрептомицин.
Рост мицелия стимулировался при добавлении в среду железа, марганца, цинка и, особенно, меди, никеля, кобальта, алюминия.
Изучению физиологии St. alternans в связи с токсинобразованием посвящены работы Саркисова и сотрудников (1954), Трифоновой (1956), Юськива (1968). Установлено, что из природных целлюлозосодержащих субстратов токсичные расы St. alternans растут на соломе различных злаков, стеблях джута, конопли, льна, коробочках хлопчатника. Пригоден для роста и токсинобразования сусловый агар, среды Сабуро, Чапека и др. Отмечен рост гриба на стерильных тканях органов животных, чем, вероятно, можно объяснить обнаружение гиф у больных стахиботриотоксикозом животных на некротизированных от действия токсина участках тканей (Мельниченко, 1949).
По данным Трифоновой (1956), на рост St. alternans и токсинобразование положительно влияют увеличение концентрации глюкозы в среде, добавление витаминов — В1, С и особенно никотиновой кислоты (0,25 мкг/мл). Максимум токсинобразования при поверхностном культивировании гриба отмечен на 7—15-й день и связан с наступлением обильного спорообразования. При глубинном культивировании максимум токсинобразования наступает на 2—5-й день и
зависит от аэрации и других условий. Юськив (1968) провел сравнительное изучение пригодности различных источников углеродного и азотного питания на рост и токсинобразование у остротоксического и атоксического штаммов St. alternans. В качестве источников углерода автор исследовал различные углеводы и их производные, спирты алифатического ряда, органические кислоты трикарбонового цикла (всего 42 источника). В качестве источников азота изучались различные аминокислоты и соли аммония, вносимые также по эквивалентному содержанию азота в среде Чапека. Отсутствие роста (или незначительный рост) отмечено на средах с ксиланом, лигнином, сорбозой, инозитом, спиртами алифатического ряда, органическими кислотами. Спорообразование не обнаружено на средах с лактозой и глицерином.
а — остротоксичный штамм 12694 (1 — арабиноза, галактоза, аспарагин, крахмал- 2—глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза- 3 — декстрин, рафиноза, целлобиоза- 4 — пектин- 5 — аланин- 6 — лейцин- 7 — д-триптофан, целлюлоза)- б — слаботоксичный штамм 14088 ( 8 — арабиноза, 9 — мальтоза, 10 — крахмал).
Рис. 37. Токсичность культуральной жидкости St. alternans для белых мышей в зависимости от источников углерода и азота:
По активности токсинобразования пригодность источников углерода располагалась в убывающем порядке: арабиноза, галактоза, крахмал, глюкоза, сахароза, мальтоза, лактоза, рафиноза, целлобиоза, декстрины (рис. 37). Не отмечено токсинобразования при росте гриба на средах с маннитом, сорбитом и дульцитом. Интенсивность роста и токсинобразования у остротоксического штамма значительно выше, чем у слаботоксического. Максимальная токсичность у первого отмечалась через 36— 48 ч, у второго — незначительная на 10—12-й день и только на средах с арабинозой, мальтозой и крахмалом.
Хороший рост гриба отмечен при использовании аминокислот глицина, а-аланина, триптофана, лейцина, аспарагина (источник углерода — сахароза)- наблюдалось значительное образование темно-коричневого пигмента на средах с триптофаном. При росте на средах с остальными аминокислотами, а также аммонийными солями неорганических и органических кислот наблюдался слабый рост в виде отдельных дерновинок и мицелия наподобие клеток хламидоспорового типа.
При погруженном культивировании St. alternans в колбах на среде Чапека с 3%-ной сахарозой максимум суммарного выхода неочищенного стахиботриотоксина отмечен на 6—8-й день, значительная его часть содержалась в мицелии. К этому сроку количество сахара в среде снижалось почти вдвое: хроматографически обнаружены глюкоза и сахароза. Максимум содержания аминного азота в
мицелии наступает на четвертый день роста, значительно снижается к восьмому дню, причем до шестидневного возраста две трети общего количества азота составляет азот белков мицелия и одну треть — азот свободных аминокислот. Начиная с четырехдневного возраста мицелий и культуральная жидкость приобретают темно-коричневочерную окраску. Пигмент не растворим в хлороформе и эфире, но растворим в ацетоне, адсорбируется на угле. 
Рис. 38. Спектры поглощения УФ-лучей (а) и хроматограмма (б) на тонком слое алюминия различных компонентов стахиботриотоксинов I, II, III (сг — светло-голубое свечение, ок — оранжево-красное).
*Добавлены каждый из расчета 4 мг С/мл, в скобках — вес мицелия в мг/мл.
Методом бумажной хроматографии выявлено, что преобладающими аминокислотами белка мицелия в данных условиях культивирования являются глутаминовая, а-аланин, пролин, метионин, р-фенил-бета-аланин, а в четырех —шестидневном возрасте еще и аспарагиновая, серин, глицин, валин. В мицелии не обнаружено орнитина, треонина, лейцина. Из несвязанных аминокислот на 2—4-й день отмечено наличие глутаминовой, аспарагиновой, аргинина, а-аланина и их следы в культуре шести — восьмидневного возраста (рис. 38).
Первые исследования химической природы токсинов St. alternans, содержащихся в мицелии и конидиях гриба, проведены Фиалковым и Серебряным (1949). В опытах использовался высокотоксический штамм гриба, который культивировали на сусловом агаре в течение 30 дней. Исследованию подвергались мицелий и конидии из чашек Петри.
Токсины из мицелия и конидий экстрагировали серным и петролейным эфирами, хлороформом, 90°-ным этанолом, ацетоном, бензолом, дистиллированной водой, 0,1 н. NaOH и 0,1 н. НС1. По данным авторов, вода и 0,1 н. НС1 извлекали мало токсина. Наиболее активно извлекались вещества этанолом, хлороформом и эфиром. При извлечении веществ 0,1н. NaOH мицелий превращался в коллоидный раствор темно-бурого цвета.
Токсин многократно экстрагировали в водяной бане при 40— 45° С до получения неокрашиваемых растворителей и исчезновения видимого осадка после удаления растворителя. Наиболее токсичными оказались эфирные экстракты, которые при внутривенном введении вызывали у лошадей отравление, характерное для стахиботриотоксикоза. Эти вещества были названы стахиботриотоксинами. В эфирный экстракт переходят также стерины. Характерные цветные реакции следующие.
- Резорциновая *. К 1 мл эфирного экстракта стахиботриотоксина добавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и несколько кристалликов резорцина. Соляная кислота окрашивается в интенсивный красный цвет, через 24—48 ч выпадает красный осадок. Аналогичная реакция отмечена с орцином, пирокатехином, гидрохиноном (Юськив, 1965).
- Реакция с концентрированной соляной кислотой *. К 1 мл эфирного экстракта добавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, которая окрашивается в красный или вишнево-красный цвет.
- Реакция с концентрированным раствором аммиака (по Фиалкову и Серебряному, 1949). К 1 мл эфирного экстракта добавляют 5—7 мл 96°-ного этанола, осторожно подогревают и затем добавляют 5—7 мл концентрированного водного раствора аммиака (25%). Смесь кипятят 5—10 мин- вначале появляется интенсивная черно-фиолетовая окраска, затем выпадает осадок черного цвета.
- Реакция Либермана — Бурхардта (на стерины и некоторые стероиды). 2—3 мл эфирного экстракта досуха выпаряют, остаток растворяют в хлороформе и к раствору добавляют немного уксусного ангидрида, полученную смесь осторожно наслаивают на концентрированную серную кислоту. На границе двух слоев появляется зеленое кольцо, принимающее затем фиолетовую и бурую окраски.
Выделение стахиботриотоксина из эфирных экстрактов авторы проводили растворением остатка 96°-ным этанолом, осаждением дистиллированной водой и последующей многократной очисткой. Полученные указанным способом вещества давали положительные реакции с резорцином, соляной кислотой и аммиаком, а также отрицательную реакцию Либермана — Бурхардта. По физическим свойствам каждое вещество (например, токсин А) представляло собой бесцветный или бледно-желтый аморфный порошок, слабо растворимый в воде, хорошо растворимый в эфире, этаноле, хлороформе, ацетоне, анизоле, пиридине. Маслоподобный остаток давал положительную реакцию на стерины.
Установлены другие качественные реакции на стахиботриотоксин: растворимость в крепких растворах едкого натра и серной кислоты, обесцвечивание брома хлороформными растворами токсина с образованием желтого осадка и бромистого водорода, обесцвечивание щелочными растворами токсина 1- и 5%-ного перманганата калия, а спиртовыми растворами токсина St. alternans — фуксинсернистой кислоты, восстановление при длительном кипячении аммиачного раствора серебра с образованием зеркала, положительная реакция с метафенилдиамином и реакция на некоторые лактоны (Легаля, с пикратом натрия). В разбавленных растворах едкого натра стахиботриотоксин дает желтое окрашивание, постепенно буреющее, при подкислении щелочных растворов токсина разбавленными серной или соляной кислотами выпадает аморфный осадок, дающий качественные реакции на токсин. При действии на спиртовой раствор токсина концентрированным аммиаком раствор окрашивается в зеленый цвет, затем в коричневый- после кипячения смеси и отстаивания выпадает аморфный порошок черно-коричневого цвета (N-производное стахиботриотоксина). Это вещество в 10 раз слабее действует на изолированное сердце лягушки и дает отрицательную кожную реакцию. Йод и бром-производные дают положительную реакцию с резорцином и отрицательную — с концентрированной соляной кислотой и аммиаком. На основании проведенных исследований установлена формула стахиботриотоксина (С26-25Н38-39О6) и его молекулярный вес (446,3—430,3). Стахиботриотоксин, по мнению авторов, относится к стероидам, производным пергидроцикло- пентенофенантрена, имеющим в боковой цепи ненасыщенную лактонную группировку (как у генинов растительных сердечных ядов или буфогенинов), лактонное кольцо (аналогичное, возможно, таковому сцилларцина А и буфогенинов), построенное по типу лактонного кольца кумарина- имеет четыре гидроксильные группы и одну активную двойную связь, по-видимому, в ядре. Авторы полагают, что стахиботриотоксин образуется грибом из стеринов в результате их биологического окисления.
Таким образом, установлено, что стахиботриотоксин представляет новую группу природных ядов, останавливающих сердце в систоле. Этот токсин отличается от сердечных глюкозидов, эфиров субериларгинина, буфогенина не только по химическим свойствам, но и по физиологическому действию. Методом тонкослойной хроматографии показано, что при погруженном культивировании на среде Чапека St. alternans образует три фракции токсических веществ: две — в мицелии Rf 0,6 (II) и Rf 0,92 (I) и одну — в культуральной жидкости (Rf 0,6). Фракции из мицелия близки к стахиботриотоксинам А и Б. Фракция I дает оранжево-коричневого цвета люминесценцию в ультрафиолетовых лучах, фракция II (А) — яркую, светло-голубоватую. Максимум поглощения фракции II (А) составляет 238— 240 ммк, фракции I (Б) — 238—240 и 278—280 ммк. Фракция III из культуральной жидкости имеет Rf 0,6- максимум поглощения в ультрафиолетовых лучах — 233—240 и 278—280 ммк (Юськив, 1968).
Пашевич (1950) считает, что стахиботриотоксин имеет как связанные, но легко освобождающиеся, так и свободные кислотные группы. Токсин стабилен при хранении и устойчив к воздействию температуры — выдерживает без значительной потери токсичности температуру 120° С в течение 2 ч.Устойчив также к воздействию минеральных и органических кислот, КМп04, действию света и ультрафиолетовых лучей. По данным Бакай (1944), мицелий и конидии устойчивы к воздействию рентгеновских и ультрафиолетовых лучей. После пятичасовой экспозиции гриб не терял жизнеспособности.
Стахиботриотоксин не устойчив к воздействию щелочей: при обработке пораженной соломы или токсина 0,5%-ными растворами NaOH или КОН и 1%-ным раствором аммония происходит инактивация токсина.
Stachybotrys lobulata В е г к.—стахиботрис мелколопастной
Вид, близкий по морфологическим и культуральным признакам к St. alternans, обладает слабовыраженными токсическими свойствами, проявляющимися, главным образом, у культур старого возраста. Распространен преимущественно в Южной Европе и Южной Азии.
Таблица 19
Токсичность разных штаммов Stachybotrys alternans
и St. lobulata
Показатели | St. alternans | St. lobulata |
Количество изученных штаммов | 21 | 16 |
Из них: | ||
токсических по резорциновой реакции | 13 | 4 |
токсических по кожной пробе | 5 | 2 |
Количество погибших животных | 21 | 16 |
Из них | ||
на 5—7-й день | 10 | 2 |
» 8-й » | 6 | 5 |
» 10—14-й » | 5 | 9 , |
Юськив (19686)при сравнительном изучении токсичности штаммов St. alternans и St. lobulata различного происхождения показал, что при проведении резорциновой пробы 13 культур St. alternans дали положительную реакцию, 5 — резко положительную кожную реакцию. При скармливании животным зараженных кормов в разной степени токсичными оказались все штаммы- из 16 штаммов St. lobulata положительная резорциновая реакция отмечена у 4 штаммов, слабоположительная кожная проба — у 2- при скармливании животным токсичными оказались все 16 культур, но значительно слабее, чем штаммы St. alternans (табл. 19).
