Методы культивирования токсических микромицетов - токсинобразующие микроскопические грибы
Г л а в а 4. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ МИКРОМИЦЕТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ТОКСИЧНОСТИ
Методы изучения токсических грибов весьма разнообразны и во многом подобны методам микологических и микробиологических исследований. Это — выделение из зерна, продуктов и кормов, а также культивирование и определение токсичности.
Правильное взятие образцов имеет важное значение для успешного исследования грибной флоры. Для микологического анализа берется образец весом около 200 г. Он отбирается из средней пробы, составляемой по общепринятому способу: щупом из разных мест. В зависимости от обстоятельств методы взятия образцов могут изменяться, но при этом должно выполняться одно условие: необходимо, чтобы полученный образец возможно более полно отображал состояние корма в исследуемой партии.
Изучение грибной флоры следует проводить прежде всего в очагах, подозреваемых на недоброкачественность корма. Они обычно хорошо заметны, так как представляют собой потемневшие гнезда или прослойки нередко со специфическим запахом плесени.
Если микологическое исследование продуктов или кормов вызвано необходимостью выяснить причины заболевания человека или животных, то помимо сведений, приводимых в прилагаемой к образцу этикетке (наименование хозяйства, время и место взятия образца), желательно также иметь данные хотя бы об основных признаках течения заболевания.
В лаборатории производится общий осмотр образца. Для этого его раскладывают на чистой, лучше всего белой бумаге и производят осмотр. Учитывается общее состояние образца: нормальная или ненормальная окраска, наличие или отсутствие видимых признаков заплесневения, грибов (например, ржавчинных или головневых), поразивших растения во время вегетации, наличие или отсутствие запаха плесени и т. п. Стебли, листья, соцветия с замеченными на них грибными повреждениями исследуются с помощью микроскопа. Препараты для просмотра под микроскопом готовят соскабливанием грибного налета, дерновинок, спорокучек и т. д. Их соскабливают чистым скальпелем, переносят в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и просматривают. По обнаруженным спорам или спороношениям судят о роде, часто также о виде и степени развития гриба на исследуемом корме. При наличии на образцах спороношений этот метод анализа при тщательном его выполнении неизменно дает хорошие результаты.
Для определения степени поражения соломы St. alternans проф. Н. А. Наумов (1937) предложил метод смыва спор с исследуемого образца корма. Для этого образец корма и соломинки нарезают мелкими кусочками, складывают в колбочку, заливают чистой водой до погружения всего слоя и в течение 20 мин периодически взбалтывают. Полученную таким образом взвесь спор чистой пипеткой наносят каплями на предметные стекла (не менее 20 капель). Капли накрывают покровными стеклами и просматривают под микроскопом.
Этот метод может быть с успехом применен и для установления наличия на субстрате других видов грибов, образующих спороношения на поверхности, но при условии, если споры легко смываются водой. Если взвесь спор получается недостаточно густой, что затрудняет возможность сделать четкие выводы, тогда водную взвесь из колбочки надо слить, осадить споры с помощью центрифуги и осадок исследовать, как обычно.
Применение двух указанных методов позволит установить наличие заражения субстрата многими видами грибов. Однако определение грибов только по спорам далеко не всегда возможно, хотя, пользуясь методом соскабливания, в препаратах обнаруживаются и другие органы. Кроме того, на исследуемом образце грибы не всегда бывают в виде спор, а часто лишь в мицелиальной стадии. К тому же и мицелий может находиться, по крайней мере в основной своей массе, внутри зерна, стеблей и других органов растений. Определить вид гриба только по мицелию, за немногими исключениями, почти невозможно. Для исследования сапрофитных грибов на кормах их в большинстве случаев нужно выращивать или даже выделять в чистые культуры. Поэтому в качестве дополнения к первому из описанных методов весьма удобно применять так называемый метод накопления. Исследуемый субстрат нарезается кусочками (если это зерно, то целиком) и накладывается в стерильные чашки Петри на несколько слоев стерилизованной фильтровальной бумаги. Затем в чашки прибавляют стерилизованную воду в количестве 5 мл на чашку диаметром 12 см и оставляют при температуре около 25° С. Следует избегать образования излишка воды, так как наличие водной пленки на поверхности корма задерживает рост многих грибов. Грибы, находящиеся в субстрате в более или менее развитом состоянии, обычно на второй-третий день дают обильный рост. Рост спор на поверхности субстрата заметен лишь через несколько дней.
Развитие грибов на исследуемом образце наблюдают в течение недели. Иногда срок увеличивают, если возникает необходимость проследить за развитием определенных видов грибов. Во избежание подсыхания субстрата в чашке при продлении срока наблюдения в нее добавляют несколько миллилитров стерильной воды. Анализ грибной флоры производится лучше всего при помощи бинокулярной лупы с увеличением 24. Для рассматривания отдельных спороношений иногда нужны более сильные увеличения. Данный метод позволяет проводить возможно более полный анализ видового состава сапрофитных грибов. Интересующие исследователя грибы снимаются препаровальной иглой или скальпелем, наносятся на предметные стекла и исследуются под микроскопом.
Выделение чистых культур при таком методе исследования проводится очень просто. Для этого стерильной платиновой иглой с конидиеносца или спорангия в поле зрения объектива снимается несколько спор, которые затем переносятся на питательную среду в пробирки. Заметить отдельные конидиеносцы многих грибов и снять с них конидии платиновой иглой можно пользуясь увеличением 24.
Данный метод в сочетании с соскабливанием дает вполне удовлетворительные результаты. Грибы, поразившие зерно или грубый корм, легко обнаруживаются, если чашки Петри с образцами поместить в термостат с температурой 37° С.
Для выделения чистых культур грибов из субстрата можно пользоваться методом смыва. Для этого после 20-минутного взбалтывания исследуемого образца в стерильной воде и в стерильной колбочке полученную взвесь в количестве 0,5 мл отбирают стерильной пипеткой и переносят в стерильную пробирку, куда добавляют 4,5 мл стерильной воды. После взбалтывания смесь высевают на агаровые среды в чашки Петри. Посев лучше производить путем добавления 1 мл взвеси к 9 мл расплавленной и остывшей до 45° С агаровой среды, которая затем разливается в чашки Петри. По мере роста колоний из чашек делаются пересевы спор или мицелия в отдельные пробирки или чашки с питательной средой. В деталях этот метод можно видоизменять. Однако для получения чистых культур грибов из зерна, продуктов и кормов он имеет ограниченное значение. Во-первых, далеко не все грибы, поразившие субстрат, могут находиться в стадии спороношения и, как уже говорилось выше, не все споры в одинаковой степени доступны смыву- во-вторых, могут смываться споры грибов, по своим биологическим особенностям не способные поражать данный вид образца в естественных условиях и поэтому являющиеся случайными- в-третьих, виды, поразившие субстрат, на искусственной среде нередко могут быть угнетены именно случайными грибами и не дать роста.
Пораженность злаков спорыньей определяется по наличию склероциев («рожков») в колосьях хлебных злаков и кормовых трав или в навеске зерна по действующим правилам учета. Для определения эрготоксинов в муке пользуются качественной реакцией на соду. Приводим пропись реакции по Мишустину и Трисвятскому. К 10 г муки добавляют 20 мл серного эфира, подкисленного 1 мл 10%-ной H2S04- после взбалтывания закрытые пробирки оставляют на 6—12 ч для экстракции токсина, а затем отделяют эфир от муки фильтрованием. К фильтрату добавляют 2 мл раствора соды (1 : 14) и дают некоторое время отстояться. При наличии спорыньи осадок приобретает четкий фиолетовый цвет. Чувствительность метода достигает 0,05%.
*Загрязненность зерна головней определяется путем прямого подсчета пораженных зерен, а также спор гриба в навеске. Учет распыленных головневых спор в навеске производят путем смыва с зерна водой и с помощью счетной камеры.
Пригодность для употребления исследуемых партий пищевого и кормового зерна определяют согласно существующим ГОСТам. Степень пораженности зерна грибами устанавливают при проращивании не менее 400 зерен из разных частей образца прямым подсчетом и микроскопией участков мицелия, выросшего из пораженного зерна с последующим определением видов в выделенных чистых культурах. При этом необходимо учитывать, что поражение, особенно видами Fusarium, может происходить как во время вегетации растений, так и при хранении, которое при благоприятной погоде (повышенной влажности) в течение продолжительного периода может оказаться значительным. При глубоком поражении колоса во время вегетации фузариозные зерна легко отличаются по внешнему виду: щуплые светло-розово-красно-коричневого оттенка, нередко на поверхности имеют розовые или оранжевые спородохии или слизевидные пионноты.
В первые сроки наблюдения на зерне обычно появляется (например, у фузариев) белый пушистый мицелий, чаще без спороношения. В это время удобно производить отсев в пробирки для получения культур. При глубоком поражении видами аспергилла, пеницилла или других в раннем периоде также проводят подсчет пораженных зерен и выделение культур. В семидневном росте устанавливают степень пораженности и микроскопическим методом определяют основные виды грибов.
Для выделения грибов, разрушающих целлюлозу, взвесь спор можно высевать на стерилизованную фильтровальную бумагу, положенную на дно стерильной чашки Петри и увлажненную жидкой синтетической питательной средой без добавления источников углерода.
*
Питательные среды для выращивания чистых культур грибов
- Среды неопределенного состава: а) природные (стебли, зерно, овощи, молоко и т. д.)- б) искусственные, получаемые путем переработки природных субстратов.
- Среды определенного состава (синтетические), которые всегда являются искусственными.
По консистенции различают среды плотные (твердые), полужидкие (полутвердые) и жидкие.
Среды неопределенного состава, содержащие разнообразные пительные вещества, наиболее пригодны для высева грибов из естественных субстратов и их длительного культирования. Однако такие среды имеют общий недостаток. Химический состав субстратов, из которых они готовятся, может колебаться в зависимости от разнообразных условий. Так, например, корнеплоды, клубни, стебли и другие органы даже одного сорта растения могут иметь в той или иной степени различный состав в зависимости не только от возраста, но и от условий произрастания, хранения и т. п. Поэтому в точных опытах повторность одинаковых условий выращивания грибов на таких средах достигается трудно. Этого недостатка лишены среды синтетические. Но ввиду того, что они не содержат питательных веществ, свойственных средам неопределенного состава, рост и спороношение многих грибов на них часто происходят хуже. Поэтому состав синтетической среды приходится подбирать с учетом физиологических особенностей гриба. Обычно синтетические среды применяются при изучении физиологии грибов, для диагностики и изучения культуральных признаков. Как указывал Наумов (1937), «синтетическими» в строгом смысле слова можно считать лишь те среды, в состав которых входят только химически чистые вещества. Среды с агаром или желатиной уже будут не вполне синтетические, так как эти вещества не обладают постоянством состава. Природные среды для выращивания сапрофитных грибов, выделенных из определенного субстрата, лучше всего готовить из того же вида, на котором гриб обнаружен. Для этого стебельки, а часто и листья кормового растения нарезают равными кусочками, складывают в виде пучка и вставляют в пробирку, в которую вливается вода, с таким расчетом, чтобы пучок соломинок в нижней части был погружен в воду. Затем пробирки с приготовленным таким образом грубым кормом стерилизуются в автоклаве при давлении 1—1,5 атм в течение 30 мин. После стерилизации среда готова к употреблению. Средой, состоящей из стерилизованного корма, приходится пользоваться в ряде случаев для выделения чистой культуры гриба или для получения типичных для него спороношений. Точно так же в пробирках можно приготовить среду из зерна, изделий из него или из других исследуемых продовольственных или кормовых субстратов.
Природные среды также нередко готовят из клубней картофеля, корнеплодов моркови, свеклы, различных плодов и т. п. Для этого указанные органы растений тщательно обмывают, нарезают ломтиками соответственно диаметру пробирок, в которые их помещают, затем 30 мин стерилизуют под давлением 0,5 атм. На такие стерилизованные ломтики в пробирках высевают обычным способом грибы. Ломтики довольно быстро подсыхают, что служит помехой для роста гриба. Чтобы избежать этого, пользуются пробирками Ру, имеющими перетяжку, на которую ломтик упирается, а в резервуар, расположенный ниже, наливают воду до стерилизации. Если нет пробирок Ру, то прежде чем закладывать ломтики в обыкновенные пробирки, в них следует опустить короткие стеклянные цилиндрики и наливать воду с таким расчетом, чтобы она не достигала основания ломтика.
Для изучения отдельных групп грибов часто применяется стерилизованный рис. Для этого его насыпают в нужном количестве в пробирки или колбочки, добавляют 2—2,5 объема воды и затем производят стерилизацию при давлении 0,5—1 атм в течение 30 мин. Таким же образом готовят среды из зерна других злаков или крупы.
Из жидких природных сред часто применяется стерилизованное обезжиренное молоко. Его разливают в пробирки и стерилизуется текучим паром трое суток по 20 мин каждый день.
Искусственные среды неопределенного состава обычно готовят с применением агара или желатины. К жидкому отвару или экстракту из природного субстрата прибавляют 1—2% агара или 10—20% желатины. Затем среду греют на кипящей водяной бане или в стерилизаторе до тех пор, пока агар или желатина полностью не расплавится, потом разливают в нужную посуду и стерилизуют. Агаровые среды неопределенного состава иногда подкисляют соляной или серной кислотой. Такие среды пригодны для выращивания многих видов грибов, а развитие бактерий на них в большинстве случаев тормозится. При значительном подкислении среды, примерно до pH 4, нужно иметь в виду, что агар в такой среде после стерилизации (в особенности под давлением) не затвердевает. Поэтому сильное подкисление можно производить лишь после стерилизации, добавляя стерилизованную кислоту в еще не остывшую агаровую среду. Добавляемая кислота должна быть слабой концентрации — 1 : 10 или 1 : 15 нормального раствора. На 1 л среды обычно требуется 12—15 мл такого раствора.
При изготовлении искусственных сред неопределенного состава (как и сред синтетических) для выращивания грибов с целью морфологических исследований следует избегать внесения излишних количеств питательных веществ, так как это часто приводит к уродливому развитию грибов.
Сусловый агар. Обычное пивное сусло разбавляют водой до 7° по ареометру Баллинга (часто для этого прибавляют три объема воды), затем к нему добавляют 1,5—2% агара. В дальнейшем среда готовится как обычно, стерилизуется при давлении 0,5—1 атм.
Картофельный агар. 200 г нарезанного ломтиками, предварительно очищенного и обмытого картофеля варят 30 мин в 1 л воды, затем отфильтровуют через марлю, к фильтрату добавляют воду до прежнего объема, вносят 1,5—2% агара и в дальнейшем среду готовят, как обычно.
К картофельному агару часто прибавляют 1—3% глюкозы. Глюкоза способствует более интенсивному росту грибов, культуральные признаки которых в данном случае обнаруживаются более четко. Однако большие количества глюкозы, рекомендуемые некоторыми зарубежными исследователями, нежелательны, так как при повышенном ее содержании в среде обычно наблюдается уродливое развитие грибов.
Овсяный агар. 30 г овсяной муки или 125 г овсянки варят в 1 л воды 30 мин, затем фильтруют через марлю и добавляют воду до прежнего объема, потом агар готовят, как обычно.
Таким же образом приготавливается среда из муки или раздробленного зерна других злаков (кукурузы, пшеницы), а также из зерна бобовых растений.
При изготовлении сред из фруктов, листьев или сена 50 г нужного материала варят в 1 л воды 30 мин, затем отвар отфильтровуют, добавляют воду до прежнего объема, затем — агар или желатину и т. д. В среды, изготовленные из листьев или сена, желательно добавлять источник углерода, например глюкозу в количестве 1—3%.
Синтетические среды. Имеется большое количество рецептов, предложенных различными авторами для выращивания тех или иных групп грибов. В сущности многие из этих сред сходны по своему составу и чаще всего отличаются друг от друга количеством вносимых в них питательных веществ.
При составлении рецептов синтетических сред исходят из необходимости введения в их состав основных химических элементов, важных для питания тех или иных грибов и находящихся в усвояемых соединениях. Источниками углерода чаще всего служат: глюкоза, сахароза, мальтоза, растворимый крахмал, глицерин и маннит. Для специальных исследований применяют кроме перечисленных и другие углеводы и спирты, а также соли органических кислот, аминокислоты, являющиеся одновременно источником углерода и азота, и т. п. Для разрушающих целлюлозу грибов как источник углерода применяют обычную фильтровальную бумагу (лучше всего беззольные фильтры), иногда — гигроскопическую вату, увлажненную жидкой минеральной средой.
Для грибных сред используют разнообразные источники азота. При этом учитывают неодинаковую способность многих грибов усваивать нитратный, аммиачный и аминный азот. Источниками нитратного азота чаще всего являются азотнокислый калий, азотнокислый натрий и азотнокислый аммоний- последний служит одновременно источником аммиачного азота.
Аммиачный азот вносят в среду в виде аммонийных солей различных кислот. Чаще всего для этого применяют сернокислый, хлористый, азотнокислый или фосфорнокислый аммоний. Последний одновременно является источником фосфора (в зависимости от необходимой реакции среды используют одно-, дву- или трехзамещенный фосфат).
В качестве источников фосфора в синтетических средах обычно применяется фосфорнокислый калий или фосфорнокислый натрий. Предпочитают однозамещенные соли фосфорной кислоты, как более кислые. В некоторых случаях, однако, применяют также двузамещенные соли. Иногда для получения нужной реакции среды однозамещенную соль при добавлении в среду смешивают пополам с двузамещенной. Как источник фосфора иногда применяют и фосфорнокислый аммоний (чаще однозамещенный), являющийся одновременно и источником азота.
Источниками серы в синтетических средах обычно служат соли серной кислоты, чаще всего сернокислый магний, источниками магния — сернокислый или хлористый магний. В качестве источников калия чаще всего используется фосфорнокислый (обычно однозамещенный) или хлористый калий.
Как видно из изложенного, в составе каждой синтетической среды должны быть основные химические элементы—углерод, азот, фосфор, сера, калий и магний. Однако для нормального питания грибов часто необходимы и другие химические элементы, но в самых ничтожных количествах. Это так называемые микроэлементы. Было доказано, что нормальная черная окраска конидий гриба Aspergillus niger отсутствует, если в среде нет меди. Для того, чтобы образовалась эта окраска в культуре, необходимо взять несколько микрограммов меди на литр среды. Тем не менее на обычных синтетических средах, в состав которых соединения меди отдельно не вносят, этот гриб развивается, образуя черные конидии. Это объясняется тем, что при составлении сред трудно получить абсолютно чистые химические соединения, к тому же с этими соединениями обычно вносятся и ничтожные количества ряда химических элементов, которые не безразличны для нормального развития гриба.
Немалое значение имеет и качество стекла лабораторной посуды, в которой выращиваются культуры грибов. Ряд соединений может выщелачиваться в питательную среду из стекла. В этом отношении особенно отличаются сорта щелочного стекла, которые в зависимости от буферности среды могут способствовать более или менее быстрому ее подщелачиванию. Поэтому для исследований применяют посуду из нейтрального стекла «пирекс». Для более точных опытов пользуются не только специально и самым тщательным образом очищенными реактивами, но также особым способом перегнанной несколько раз дистиллированной водой и кварцевой посудой. Синтетические среды в неизмеримо большей степени обеспечивают сравнимость условий при повторности опытов, чем среды неопределенного состава.
Большинство синтетических сред, предложенных для выращивания чистых культур многих видов грибов, имеет pH от 4,5 до 6,5. Кислотность в таких пределах является наиболее благоприятной.
Среда Чапека
Сахароза 30 г
Натрий азотнокислый 2 »
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 »
Магний сернокислый 0,5 »
Калий хлористый. 0,5 »
Железо сернокислое (закисное) .. 0,01 »
Вода дистиллированная до .. 1 л
Агар 15—20 г
Указанная среда наиболее часто применяется для исследования грибов. Источник углерода — сахароза может быть заменен в таких же весовых количествах глицерином, глюкозой и другими углеводами (pH 6—6,2) Если необходимо довести эту среду до реакции, близкой к нейтральной, то, вместо обычных приемов подщелачивания, нередко вносят 0,5 г фосфорнокислого однозамещенного калия и 0,5 г двузамещенного на 1 л среды.
Упрощенная среда Ролена
Сахароза 30 г
Азотнокислый аммоний 2,5 »
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1 »
Магний сернокислый 1 »
Железо сернокислое (закисное) 0,01 »
Агар.. 20 »
Вода дистиллированная . 1 л
Целлюлозная среда. Чистую фильтровальную бумагу (лучше всего взять беззольные фильтры) нарезают полосками, складывают так, чтобы получились продольные складки, и закладывают в пробирки. После этого в них добавляют 2—3 мл жидкой среды Чапека или упрощенной среды Ролена без источника углерода (минеральную часть) с таким расчетом, чтобы полоски бумаги погрузились в нее своими основаниями. Затем стерилизуют при 15° С в течение 30 мин. Посев грибов производят на влажную бумагу. По активности роста на фильтровальной бумаге судят о способности гриба разрушать целлюлозу. Иногда в качестве источника углерода в аналогичных случаях применяют гигроскопическую вату.
Культивирование грибов на предметных стеклах
Культивирование грибов на искусственных питательных средах дает возможность всесторонне изучать их морфологию и физиологию. Однако при изучении морфологии грибов во время их роста бывает необходимо производить наблюдения над процессами роста и спорообразования непосредственно под микроскопом. Для этой цели многие виды сапрофитных грибов культивируют на предметных стеклах.
Поверхность чистого предметного стекла прокаливают над пламенем спиртовой горелки и кладут в горизонтальном положении (прокаленной стороной вниз) на какую-либо подставку так, чтобы стекло опиралось на нее лишь своими краями. Затем на прокаленную сторону стекла стерильной платиновой петлей снизу наносят небольшой кусочек агаровой стерильной среды. После этого на прикрепленный таким образом кусочек среды стерильной платиновой иглой или петлей наносят мицелий или споры исследуемого вида гриба. После посева берут чистое покровное стеклышко, прокаливают над пламенем спиртовой горелки, дают ему несколько остыть и прикладывают к предметному стеклу снизу, прижимая кусочек агаровой среды. Предметное стекло после этого можно снять, а покровное стекло следует осторожно придавить таким образом, чтобы агаровая среда образовала тонкий слой. Покровное стекло должно лежать на предметном так, чтобы одной стороной вплотную прикасалось к предметному стеклу и располагалось по отношению к нему под углом 10—15°. Для уменьшения возможности загрязнения культуры иногда бывает целесообразно залить расплавленным парафином три смежные стороны покровного стекла, кроме одной стороны, наиболее удаленной от поверхности предметного стекла. Во избежание подсыхания среды полученный «живой препарат» помещают во влажную камеру с таким расчетом, чтобы наиболее открытая сторона культуры была направлена вниз или, другими словами, чтобы вершина угла, образуемая покровным и предметным стеклами, была направлена вверх. Выращивание гриба на предметном стекле производится при нужной температуре в термостате или в комнате. Наблюдения под микроскопом можно проводить в любое время- в периоды между наблюдениями препарат нужно хранить во влажной камере.
Приготовление препаратов для микроскопических исследований
Самый простой вид препаратов для микроскопических исследований грибов — это водные препараты. На чистое предметное стекло наносят каплю чистой воды, затем на кончике препаровальной или платиновой иглы в нее вносят небольшое количество исследуемого материала и прикрывают чистым покровным стеклом. После этого препарат готов для рассматривания под микроскопом. Однако такие препараты имеют существенные недостатки. Вода в них быстро высыхает, и препарат становится непригодным для рассматривания под микроскопом. Поэтому при длительном изучении препарата приходится постоянно прибавлять воду под покровное стекло. Кроме того, в воде быстро распадаются цепочки спор и растворяются оболочки спорангиев большинства видов мукоровых грибов, что затрудняет микроскопические исследования. Этих недостатков в значительной степени лишены препараты, в которых вместо воды применяется смесь из спирта, глицерина и воды, взятых в равных объемах. В таком растворе цепочки спор распадаются медленнее, чем в воде, и изготовленные на нем препараты могут храниться в течение нескольких недель.
В ряде случаев для обнаружения цепочек спор под микроскопом приходится готовить препараты на чистом спирте, прибавляя его под покровное стекло по мере подсыхания объекта. Для уменьшения высыхания препарата бывает целесообразно заливать его по краям покровного стекла парафином и заделывать вазелином.
Препараты, которые нужно сохранять в течение многих месяцев можно готовить на глицерин-желатине следующего состава:
Желатина высшего качества 1 весовая часть
Глицерин чистый7 весовых частей
Вода. 6 » »
Тимол или фенол.. Следы
После нагревания глицерин-желатина образует гомогенную массу и хранится в закрытой посуде. Перед употреблением ее разжижают нагреванием, и каплю наносят на предметное стекло. Затем в эту каплю вносят во влажном виде исследуемый материал, плотно покрывают покровным стеклом при слабом подогревании и исследуют под микроскопом.
Для обнаружения проростковых пор при наблюдениях за строением оболочек спор и спороносного аппарата у грибов весьма удобен метод мацерации. До рассматривания под микроскопом исследуемый объект помещают в каплю крепкого раствора едкого калия на предметное стекло, нагревают почти до кипения над пламенем спиртовки и прикрывают покровным стеклом. Можно также применять крепкий раствор хромовой кислоты, каплю которой вводят под покровное стекло водного препарата.
При микроскопическом исследовании бесцветных объектов весьма полезно производить их окрашивание. При приготовлении временных препаратов применяют метод так называемой витальной окраски. Для этой цели используется ряд красок: из основных — генциан-виолет, метилен-блау, сафранин, нейтраль-рот, анилин-блау, метил-виолет и другие, из кислых—эритрозин, оранж и некоторые другие. Концентрация красителя в растворе обычно не должна превышать 0,001—0,005%, но в ряде случаев окраска лучше удается при концентрации, равной 0,01%. Интенсивность окрашивания оболочки и содержимого клетки зависит как от самой краски, так и от исследуемой группы грибов. Общим может быть следующее положение: при повышении концентрации раствора красителя выше определенного оптимума окраска объекта получается слишком густая и сплошная, что затрудняет исследование, а при чрезмерно слабой концентрации раствора окраска остается недостаточной. Для растворения красок, кроме воды для водорастворимых красок, может применяться, например, молочная кислота (для анилин-блау), глицерин (для метилен-блау) и другие растворители, хотя окраска в этих случаях не может считаться прижизненной.
О методах исследования токсичности
Установление видов грибов, токсичных для человека и животных, является необходимым условием для предупреждения отравлений. Вполне понятно, что оно должно предшествовать изучению свойств токсических веществ, образуемых этими грибами, характера их действия на организм животных, разработке способов обезвреживания и методов лечения отравлений.
Установление токсичности отдельных видов грибов и в особенности установление их этиологической роли в тех или иных заболеваниях обычно представляет собой трудную задачу и требует участия соответствующих специалистов различных отраслей биологической и медицинской наук. Успешное решение этой задачи зависит от применяемых в таких исследованиях методов, в которых должны всесторонне учитываться особенности биологии и пластичности того или иного вида токсического гриба и микроорганизма (или животного), характер заболевания и т. д.
При выяснении природы отравлений и установлении их возбудителей методы и пути решения задачи в каждом конкретном случае могут меняться. Поэтому ниже приводятся лишь общие соображения относительно методов испытания токсичности грибов, вытекающие главным образом из задач микологических исследований. Они включают три основных пути определения токсичности грибов: установление токсичности субстрата, искусственно зараженного культурой гриба в алиментарных опытах на животных- воспроизведение заболевания, аналогичного по симптомокомплексу естественному отравлению- выделение токсических метаболитов, изучение их химической природы и биологического действия.
В том случае, когда на образце не обнаружено развития уже известного вида токсического гриба, на токсичность должны исследоваться прежде всего виды грибов, встречающихся на этих образцах в более или менее значительном количестве. Пр и этом, конечно, весьма желательно исследовать возможно большее количество образцов, так как иногда вид гриба (возбудителя заболевания человека или животных) может оказаться в небольшом количестве или даже остаться незамеченным. Кроме тщательного анализа таких образцов с применением соскабливания, следует также пользоваться возможно большей, чем обычно, повторностью анализов по методу накопления.
Выделенные в чистые культуры грибы затем высеваются в нужном количестве. Вопрос о средах для выращивания грибов с целью получения материала для токсикологических исследований имеет важное значение. Известно, что условия питания грибов оказывают значительное влияние на образование ими токсических веществ. Наиболее пригодной средой для выращивания грибов при изучении их токсических свойств является субстрат, вызвавший отравление животных. Для этого вполне доброкачественный субстрат стерилизуют в автоклаве и заражают чистой культурой исследуемого гриба при соответствующем увлажнении. В ряде случаев грибы можно выращивать на средах неопределенного состава, например на сусловом агаре, мучных агаровых средах и т. п.
Основным и решающим методом исследования токсичности гриба для животных является скармливание его или пораженного им суб-
страта. В опытах по скармливанию очень важное значение имеют также установление дозировок материала, скармливаемого животному, вид животного, его состояние, а также рацион кормления.
Алиментарные опыты с лабораторными животными проводят в двух сериях: а) острые, одноразовые скармливания субстрата, зараженного грибом или впоследствии выделенным из него веществом, и б) хронические (длительное введение в организм малых доз корма, зараженного токсическим грибом, или токсина). Это позволяет установить характерные клинические и патологоанатомические признаки, а также стадии течения алиментарного микотоксикоза.
Для решения отдельных задач при изучении токсичности грибов или исследуемого материала могут применяться и другие методы: внутривенное, внутрибрюшинное или подкожное введение животным экстрактов из токсического материала, нанесение их на депилированную (освобожденную от волос) кожу кролика или слизистую оболочку глаза. Эти методы могут быть ценными при проверке токсичности гриба, свойства токсических веществ которого уже в той или иной степени изучены. Если же свойства этих веществ не известны, то в алиментарных опытах указанные методы без проверки токсичности гриба могут привести к ошибочным выводам. При парентеральном введении в организм животного или при нанесении на слизистую оболочку глаз те или иные вещества могут оказать токсическое действие, а при скармливании некоторые из них оказываются безвредными и, следовательно, не вызывают алиментарного микотоксикоза. С другой стороны, при исследовании токсичности гриба по накожной пробе ряд токсинов, образуемых грибами, заметно не действует на кожу и в то же время может вызывать отравление животных при поедании зараженного корма. Кроме того, при нанесении экстрактов из исследуемого материала на кожу или слизистую оболочку глаза кролика или при парентеральном введении необходимо, чтобы эти экстракты действительно содержали в себе токсические вещества, образуемые грибом.
Химический метод определения токсичности зерна (и других субстратов), пораженного Fusarium sporotrichiella, предложил Олифсон. Он основан на взаимодействии токсических стеролов со щелочами, резорцином и фуксинсернистой кислотой. Поданным автора, отмечено совпадение в 82—85% с данными биопроб.
Исследуемый образец вначале экстрагируют 50%-ным этанолом, досуха высушивают, затем экстрагируют этиловым эфиром липиды и токсические стеролы. После удаления растворителя остается масло, в котором качественно определяются токсические вещества следующими методами.
- Щелочная реакция. Основана на взаимодействии стеролов, содержащих шестичленное лактонное (кумалиновое) кольцо со щелочами. Добавление к раствору щелочи эфирного экстракта при наличии стеролов вызывает образование бурого кольца на границе двух слоев.
- Резорциновая реакция. Основана на образовании окрашенных продуктов конденсации лактонов с резорцином при наличии концентрированной соляной кислоты. Характерна также для кумарина, кумалина, ароматических альдегидов.
- Реакция Либермана — Бухарда для определения стеринов с двойными связями.
- Реакция на фуксинсернистую кислоту при наличии небольшого количества аммиака. Если имеются токсические стеролы, то альдегидная группа, образуемая при действии на них аммиака, дает красное окрашивание.
- Флуоресцентный метод. Флуоресценция щелочных растворов токсических стеролов имеет желто-зеленый цвет (спорофузарионенин, поэфузариогенин, стахиботриотоксины).
Кроме специфических химических реакций для определения токсинов в последнее время используют хроматографический метод. После предварительной очистки вещество хроматографируют обычно на тонком слое силикагеля с использованием определенных систем растворителей и по значению Rf определяют наличие токсина. Хроматограммы проявляют с помощью реактивов, дающих цветные реакции с токсином, а также определением флуоресценции в ультрафиолетовых лучах или биоавтографическим методом с использованием чувствительных тест-микроорганизмов.
Последующая элюция пятна, обнаруженного на хроматограмме соответствующими растворителями, позволяет производить количественные определения содержания токсина.
Первичные биологические исследования на наличие афлатоксинов проводятся на утятах однодневного возраста, у которых обнаруживаются характерные поражения печени.
Методы определения токсичности арахиса и изделий из него были предметом исследований, проводимых во многих лабораториях Англии и других стран Европы и США. В основном они сводятся к получению метанольных или хлороформных экстрактов из токсичного арахиса или изделий из него, удалению растворителя и вторичной экстракции токсина метанолом, затем хроматографии экстракта на тонком слое окиси алюминия с применением в качестве растворителя 1,5%-ного метанола в хлороформе или силикагеля с 5%-ным метанолом в хлороформе. В этих случаях компоненты афлатоксинов В1, G1, В2, У2 определяются по флуоресценции в ультрафиолетовых лучах и соответствующему значению Rf, известному для кристаллических препаратов, последующей элюцией пятен хроматограмм с индивидуальными афлатоксинами и получением кристаллических препаратов.
Для достоверности флуоресцентного анализа и отличия афлатоксинов от других флуоресцирующих веществ в экстрактах из токсического арахиса используются также конфирматорные тесты. Предложены три реакции с афлатоксином В1, основанные на способности олефиновой связи фенольного эфирного кольца вступать в реакцию с гидроксильной группой под влиянием сильной кислоты (афлатоксин Bj содержит енольную эфирную единицу в фурановом кольце): а) тест с уксусной кислотой и тионилхлоридом- б) с муравьиной кислотой и трионилхлоридом- в) с трихлоруксусной кислотой. После добавления указанных кислот к хлороформному раствору афлатоксина смесь после удаления растворителя хроматографируется на тонком слое в 5%-ном метаноле в хлороформе. В типичных случаях (т. е. при наличии и образце афлатоксина В1) продукты реакции «а» образуют два пятна одинакового размера и со значениями Rf около 0,50 и 0,43 (Rf чистого афлатоксина — 0,50)- продукты реакции «б» дают одно пятно с Rf, равным около 0,18- продукты реакции «в» образуют два пятна: одно, аналогичное афлатоксину B1, другое с Rf, равным около 0,20. Эти тесты могут быть применены и для афлатоксина G1.
Количественное определение афлатоксинов основано на измерении оптической плотности метаноловых элюатов из хроматографических пластинок (363 mmk 363 ммк = 22 000). Токсическая арахисовая мука первоначально экстрагируется петролинейным эфиром, затем — метанолом (6ч)- метанольный раствор разводится дистиллированной водой и вновь экстрагируется в течение 6 ч хлороформом. Концентрированный хлороформный раствор хроматографируется на тонком слое силикагеля (750 мк) при использовании в качестве растворителя диэтилэфира и 2%-ного метанола в хлороформе. Элюируют холодным метанолом только четко флуоресцирующую полоску или пятно, свободное от других флуоресцирующих веществ. Количество токсина в метанольном элюате определяют по оптической плотности раствора при 363 ммк (практически 210—400 ммк). По данным авторов, чувствительность метода достигает 0,001 мкг. Предложено много различных модификаций этого метода.
