Спорынья паспаловая - токсинобразующие микроскопические грибы

Claviceps paspali Stev. et Hall.—спорынья паспаловая
Клавицепспаспалитоксикоз (Clavicepspaspalitoxicosis)
Распространен на видах Paspalum в тропических и субтропических странах. Отравления животных происходят как на пастбищах, так и при стойловом содержании при скармливании сена со склероциями гриба. Такие отравления отмечались, например, в Австралии, Новой Зеландии, Африке, Южной Америке, США, Турции и др. В СССР впервые отмечено в 1942 г. на черноморском побережье Западной Грузии на Paspalum digiiaria и P. dilatatum.
У крупного рогатого скота, лошадей и ослов наблюдалось заболевание, известное под названием «бандала» (Маградзе, 1948).
По Саликову (1944), у лошадей отравление протекает в более тяжелой форме, чем у крупного рогатого скота и свиней. В наиболее тяжелой форме оно протекает у истощенных животных и молодняка. Переболевшие животные восприимчивы к повторным инфекциям. Заболевание развивается на 2—6-й день после начала скармливания зараженного корма (травы).
Токсические вещества гриба действуют на центральную нервную систему животных. Первый признак заболевания — нарушение координации движений. Затем у лошадей возникают мышечная дрожь, угнетенное состояние и ограниченность движений, покачивание корпуса назад, вперед и в стороны. У коров отмечаются временное слюнотечение, шаткость походки, пугливость, у некоторых — расширение зрачков, повышенная возбудимость. Температура тела остается нормальной или падает ниже нормы. Слизистая оболочка рта гиперемирована. Пульс слабого наполнения. Перистальтика несколько усилена. В зависимости от продолжительности болезни (от 2—3 дней до 1—2 месяцев и более) упитанность животных снижается до полного истощения. Удои уменьшаются. Но молоко и мясо больных животных для человека безвредны.
При вскрытии обычно обнаруживаются местные очаговые поражения слизистой желудка, дегенеративное изменение сердечной мышцы и гиперплазия лимфатических, особенно мезентеральных, желез- на воспаленной оболочке желудка имеются гиперемированные участки и, в небольшом количестве, точечные кровоизлияния. Более резко выражены фокусная гиперемия и очаговые кровоизлияния на слизистой оболочке тонкого кишечника. Слизистая ободочной и слепой кишок очагово гиперемирована и местами геморрагически воспалена. Отмечается инъекция сосудов спинного и головного мозга и паренхиматозное перерождение печени.
Через два-три дня после смены корма животные выздоравливают.

Рис. 13. Структура некоторых алкалоидов С/, purpurea:
а — тетрациклическое ядро алкалоидов спорыньи, 6 — производные лизергиновой кислоты, в — производные клавиновых алкалоидов.
Предупредительные меры против заболевания заключаются в ранней косовице сена до образования конидиальной стадии (сфацелии) и склероциев, недопущении скармливания пораженных растений, уничтожении паспалума (Paspalum) в кустарниках и т. п.
При отравлении CL paspali крупного рогатого скота, лошадей и овец отмечалось, что зрелые склероции гриба менее токсичны.
чем молодые, но более токсичны, чем гриб в стадии сфацелии (Пидо пличко, 1953).
Многие работы посвящены исследованию различных аспектов биологии спорыньи и эрготизма, экологии гриба, чувствительности разных сортов ржи к заражению, условиям искусственного заражения, влиянию различных условий на токсичность склероциев, химической природе эрготоксинов и др. В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении химии и фармакологии эрготоксинов, а также метода сапрофитной культуры гриба.
В настоящее время описано большое количество токсинов спорыньи и их производных, обладающих высокой биологической активностью и широко применяемых в медицине. Эрготалкалоиды представлены двумя основными типами: клавиналкалоидами, их производными и пептидными алкалоидами, производными лизергиновой кислоты. В состав указанных типов входит ряд близких, но отличающихся строением и свойствами токсинов (рис. 13).
Алкалоиды клавинового типа, имеющие в основе эрголин (аргоклавин, элимоклавин и др.), довольно простого строения с молекулярным весом около 250. В сапрофитной культуре их получают сравнительно просто. Более сложен токсиногенез алкалоидов полипептидного типа, имеющих в составе лизергиновую и изолизергиновую кислоты. Молекулярный вес этих алкалоидов равен около 600- они отмечены преимущественно в мицелии С/, purpurea. Токсиногенез и образование алкалоидов спорыньи в сапрофитной культуре при поверхностном и глубинном методах культивирования изучались многими авторами (Abe и др., 1953, 1955, 1961, 1966- Taber, 1957- Taylor и др., 1960, и др.).
Неклавиновые алкалоиды представлены эпимерными парами — амидными производными лизергиновой и изолизергиновой кислот. Биологической активностью обладают производные лизергиновой кислоты.
Лизергиновая кислота содержит хинолиновую и индольную структуры- наличие последней обусловливает характерное синефиолетовое окрашивание ее растворов с глиоксалевой и концентрированной серной кислотами, которое используется при качественном и количественном определении эрготал кал оидов.
Более простые амидные производные лизергиновой кислоты (эргометрин и эргометринин) образуют один ряд соединений, производные с полициклической пептидной цепью (эрготамин и эрготаминин) — другой ряд (табл. 1).
В настоящее время описано большое количество производных клавиновых и лизергиновых алкалоидов, выделенных из склероциев или из сапрофитной культуры С/, paspali и С/, purpurea, отличающихся фармакологическими, токсическими и другими свойствами. Так, эрготоксин, эрготамин, эргозин действуют на гладкие мышцы, сужают зрачок, кровеносные сосуды, вызывая нарушение питания тканей (цианоз и гангрену), парализуют двигательные симпатические нервы. Эргометрин в сильной мере сокращает мускулатуру матки, но менее токсичен (не вызывает гангрены).
Определение токсинов производится различными способами: фармакологическими, химическими по цветным реакциям и интенсивности флуоресценции, УФ-спектрометрией и хроматографией (Vining, Taber, 1963).
Таблица 1
Краткая характеристика некоторых алкалоидов Cl. purpurea

Выделены штаммы СZ.|purpurea, образующие в паразитной и сапрофитной культурах преимущественно клавиновые алкалоиды или алкалоиды лизергиновой кислоты.
Тейбер и Вайнинг (Taber, Vining, 1960) изучали в сапрофитной культуре эрготалкалоидобразующие свойства у 41 штамма С/. ригригеа, выделенных из различных растений, Aspergillus flavus, Coniothyrium fuckelii, Ustilago bulata, U. trebouxii, U. maydis, Penicillium roqueforti.
Отмечено определяемое количество эрготоксина у 18 штаммов С/. purpurea и образование у P. roqueforti веществ, аналогичных по значению Rf с элимоклавином, пенниклавином и аргоклавином. Из исследованных источников углерода наиболее пригодными для образования алкалоидов оказались галактоза с примесью глюкозы- рост не отмечался на среде с дульцитом и глюконатом. В качестве источников азота более пригодными оказались аммоний янтарно-кислый, соевая мука, мочевина, дрожжевой экстракт. На среде с азотнокислым калием, мочевиной и /-триптофаном, как единственными источниками азота, рост гриба не наблюдался, но при добавлении 500 мг!л /-триптофана — к среде с янтарнокислым аммонием
выход эрготоксина в 35-дневной культуре почти удваивался. Не отмечено роста гриба на среде с винной, фосфорной, уксусной кислотами, но хороший выход эрготоксина получен на среде с янтарной кислотой. Авторы установили, что на синтез эрготоксинов значительно влияет соотношение источников углерода (галактозы) и фосфора (табл. 2).
Таблица 2
Влияние соотношения галактозы и фосфора на образование алкалоидов Claviceps purpurea

На основании проведенных исследований установлены типичные показатели роста гриба и образования алкалоидов. Последнее наступает при истощении основных компонентов среды и значительного периода (до 20 дней) роста мицелия (рис. 14).

Рис. 14. Рост и образование эрготалкалоидов Claviceps purpurea в сапрофитной культуре на среде с галактозой.
Штаммы С/, purpurea отличаются по способности образовывать алкалоиды при росте на среде с различными сахарами и источниками азота. Из исследованных штаммов 10 образовывали алкалоиды при росте на среде с галактозой, 8 — на среде с сахарозой и только один штамм — на среде с лактозой.
Изучаемые штаммы различались также по диапазону использования сахаров: один штамм образовывал алкалоиды при использовании пяти сахаров, три — при использовании четырех и т. д. Однако прямой зависимости между способностью использовать сахара и образованием алкалоидов не отмечалось. Из пяти штаммов С/. purpurea два образовали алкалоиды при росте на среде с янтарнокислым аммонием, три — при росте на среде с дрожжевым экстрактом и ни один — при росте на среде с аспарагином.
Отмечены различная активность штаммов С/, purpurea и влияние среды на общий выход и состав эрготоксинов. Добавление тиамина и цистеина несколько повышало общий выход алкалоидов. Условия, способствующие росту мицелия, не всегда благоприятствуют биосинтезу токсинов (Voigt, Keipert, 1967). Наблюдается значительная
ингибиция биосинтеза токсинов в атмосфере дейтерия (Mrtek и др., 1967).
Тайберг и Ванинг показали изменения в составе компонентов мицелия С/. purpurea, происходящие в период роста, в связи с образованием эрготалкалоидов в зависимости от различной концентрации в среде фосфатов, источников азота, а также от процесса адаптации инокулюма к использованию галактозы (Taber, Vining, 1963).
Полученные результаты позволяют считать, что интенсивность роста мицелия не является общим фактором регуляции образования эрготалкалоидов. В мицелии культур перед началом образования токсинов аккумулируются полиолы, углеводы, липиды и остается высокой концентрация водорастворимого азота и РНК.
Усиление роста мицелия при высокой концентрации фосфатов в среде не сопровождается увеличением образования эрготалкалоидов- наибольшее содержание общего азота зафиксировано при росте на среде с низкой концентрацией фосфатов. Аккумуляция РНК и водорастворимого азота является наиболее характерным показателем образования эрготалкалоидов.
Исходя из этого, авторы считают, что образование эрготалкалоидов происходит в период переходной фазы роста, характеризующейся продолжением аккумуляции азота, но не углеводных резервных веществ. При хроматографическом исследовании сахаров и полиолов мицелия С/. purpurea установлено, что главными и постоянными резервными компонентами его являются трегалоза и маннит, наличие других углеводов (глюкозы, арабита, глицерина, дульцита) зависит от состава питательной среды для культивирования гриба (рис. 15).
Показано значительное влияние неорганических компонентов среды — различных минеральных солей и микроэлементов — на рост и образование алкалоидов лизергинового ряда (Rosarra и др., 1967).
Авторы использовали штаммы Claviceps paspali, образующие лизергиновую кислоту и ее производные. В частности, установлено существенное влияние минерального состава водопроводной воды на образование алкалоидов, в связи с чем рекомендованы среды со специальным составом минеральных солей, стимулирующих синтез алкалоидов лизергиновой кислоты.
Авторы селекционировали штамм С/. paspali, который при культивировании гриба на этих средах образовывал более 1000 мкг алкалоидов на 1 мл среды.
В первой стадии роста гриб культивировался на основной среде с 4%-ным маннитом, 1%-ной янтарной кислотой и микроэлементами, во второй — на среде с 5%-ным маннитом и 3%-ной янтарной кислотой. В третьей стадии определяли рост и образование алкалоидов в зависимости от наличия некоторых минеральных солей и микроэлементов: Са (N03)2 -*H2OJ(l,27 • 10-3), MgS04 • 7H20 (3,25 x X КГ3), ZnS04 • 7H20 (1,74 • КГ5), FeS04 • 7H20 (1-80 • 1(T4), CuS04 • 5H20 (2,01 • 1(П5), MnS04 • 4H20 (4,48 • 10-5), NaNO,
(1,19 • 10-3), KH2P04 (7,35 • 10~3) в молях на литр. Установлено, что для штамма С/, paspali потребность в калии и магнии для роста мицелия была такой же, как и при алкалоидообразовании.

Рис. 15. Изменение состава эндогенных сахаров и полиолов в мицелии
Claviceps purpurea в зависимости от состава питательной среды:
а — глюкоза и сукцинат аммония, б — галактоза и сукцинат аммония, в—манноза и сукцинат аммония, г— маннит и сукцинат аммония.
Максимум роста отмечен при более низкой концентрации фосфора, железа, цинка, чем при образовании алкалоидов. Марганец и медь существенно влияли на синтез алкалоидов (рис. 16).
Шалагина и сотрудники (1965) изучали образование алкалоидов у 32 штаммов С/. purpurea, выделенных из склероциев злаковых трав, пшеницы, ржи в различных географических районах СССР. Грибы культивировались в поверхностной культуре на среде следующего состава (в г!л): сахарозы — 75, сорбита — 25, аммония лимоннокислого — 5, КН2Р04 — 0,25, Са (ON3)2 — 1,5, MgS04 — 0,25, КС1 — 0,125, ZnS04 - H20 — 0,00003, FeS04 . 7H20 — 0,03, цистеина — 0,01, аневрина — 0,0001, биотина — 0,000001 (pH 6,5). Наличие токсинов в мицелии определяли в полтора-двухмесячной культуре. Большинство изученных штаммов при данных условиях образовывали эргокриптин и эрготамин- последний был преобладающим, он составлял до 80% всего выхода алкалоидов.

Рис. 16. Влияние микроэлементов на рост мицелия и образование эрготалкалоидов в сапрофитной культуре Claviceps paspali:
а — калий, б — фосфор, в — магний, г — сера, д — железо, е — цинк, ж — марганец
з — медь (1 — мицелий, 2 — эрготалкалоиды).
Их общее  содержание равнялось около 0,03% по отношению к сухому весу мицелия (табл. 3).
Таблица 3
Состав алкалоидов, образуемых различными штаммами CL purpurea

Кастаньоли и Мантл (Costaghnoli, Mantle, 1966) исследовали строение алкалоидов, образуемых в сапрофитной культуре штаммами С/, purpurea, изолированными из различных трав. Было показано, что у штамма изолированного из Spartina townsendii при pH 8,5 извлекается хлороформом из фильтрата около 40% токсинов, остальное количество — бутанолом при pH 3,5. Хроматографией хлороформного экстракта на бумаге и в тонком слое силикагеля в большом количестве был получен хеноклавин и в незначительном — элимоклавин и эрготоксин. При хроматографии л-бутанольных экстрактов авторы у этого штамма обнаружили d-лизергиновую кислоту и ее изомер 6-метилэргол-8-еле-8-карбоксил кислоту. d-Лизергиновая кислота в незначительном количестве ранее была изолирована из фильтратов штаммов С/, purpurea, выделенных из Pennisetum typhoideum.
Костаньоли и Тоноло (1966) изучали образование эрготалкалоидов CL purpurea и С/, paspali в погруженной культуре. Установлено, что в сапрофитной культуре синтез эрготалкалоидов происходит у аспорогенных штаммов (не образующих конидий). У активных алкалоидобразующих штаммов, особенно в погруженной культуре, гифы мицелия по характеру роста и функциональной активности имеют ряд фаз. Фаза, характеризующаяся наличием типичной склероциальной структуры мицелия с короткими утолщенными клетками и обильными включениями жира, связана с образованием эрготалкалоидов.
При культивировании штаммов С/, purpurea и CL paspali на пептонно-маннитной среде отмечено пятикратное увеличение выхода токсинов при повышении концентрации сахара от 5 до 25%.
Растущие клетки и неклеточные экстракты изучаемого штамма CL purpurea в сапрофитной культуре содержат ферменты, осуществляющие разные пути метаболизма глюкозы. При росте в погруженной культуре на сахарозно-минеральной среде или среде с мочевиной и дрожжевым экстрактом в неклеточных структурах обнаруживаются гексокиназа, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа, дегидрогеназа 6-фосфоглюконовой кислоты, альдолаза, ферменты пентозного цикла (Me Donald и др., 1960). Радиографически установлено относительное значение различных путей метаболизма глюкозы у гриба: 90% глюкозы превращается растущими клетками в результате гликолиза и цикла Кребса, 10% глюкозы усваивается путем пентозо- фосфатного цикла. Ферментативные пути разрушения алкалоидов исследовались при окислении их пероксидазой хрена (Taylor, Shough, 1967), декарбоксилировании меченых триптофана и его производных в молекуле аргоклавина и алимоклавина (Plieninger и др., 1967)- выявлены специфические ферментативные реакции гидроксилирования у многих видов грибов (Beliveau, Ramstad, 1966, и др., Оранская, Гончарова, Безбородов, 1969).
Установлена различная потребность гриба в фосфатах для максимального роста мицелия и образования эрготалкалоидов. В процессе роста гриба значительно уменьшается содержание ортофосфата в культуральной жидкости, снижаются образование кислоторастворимых, кислотонерастворимых полифосфатов и использование первых в связи с увеличением содержания РНК (табл. 4).
Таблица 4
Соотношение фосфатов в процессе роста Claviceps purpurea

* В процентах Р04 от экзогенного КН2Р04.

Как видно из табл. 4, в 35-дневной культуре CL purpurea при максимуме образования эрготалкалоидов значительная часть экзогенного фосфата использовалась для образования РНК. Предполагают, что соотношение уровня образования РНК и количества кислотонерастворимых полифосфатов типично для токсинобразующего штамма С/, purpurea. Изучено влияние пуриновых производных и энергетических фосфатов на синтез РНК, образование эрготалкалоидов и содержание фосфатов (Waart, 1960, 1961).
Предложен ряд схем биосинтеза клавиновых алкалоидов и алкалоидов лизергиновых кислот. В опытах с меченым а-триптофаном по94 казано, что он является предшественником лизергиновой кислоты. Грегер (Groger et al., 1961, 1964, 1966) показал, что триптофан является предшественником клавиновых алкалоидов у клавинобразующих штаммов CL purpurea в сапрофитной культуре. Последовательность их биосинтеза идет по схеме: триптофан элимоклавин хеноклавин -> агроклавин элимоклавин производные лизергиновой кислоты.
Тэйлор и Рэмстед (Taylor, Ramstad, 1960) нашли, что мевалоновая кислота служит предшественником изо-изо-пентениловой части лизергиновой кислоты.
Плинингер (Plieninger, 1965) считает, что биосинтез эрготоксинов осуществляется по следующей схеме: агроклавин элимоклавин лизергиновая кислота -> эрготалкалоиды.
Костаньоли и Мэнтл (Costahgnoli, Mantle, 1966) исследовали пути биосинтеза карбиноламидной боковой цепи — оксиэтиламида лизергиновой кислоты, имеющей структурное сходство с пептидными боковыми цепями алкалоидов типа эрготамина. В опытах авторов алкалоид путем пиролиза превращался в ацетальдегид и амид лизергиновой кислоты- было показано, что из многих веществ, входящих в молекулу алкалоида, только аланин и пируват в значительной степени включались в боковую цепь (табл. 5).
Таблица 5
Включение радиоактивных веществ в молекулу а-оксиэтиламида лизергиновой кислоты

Мэйер, Кибал и Комерсова (Mayer, Kybal, Komersova, 1967) исследовали эрготамин и эрготоксинобразующие штаммы гриба. При их росте на среде с меченым аланином в гидролизатах эрготоксина значительная часть радиоактивности содержалась в валине и лейцине. Меченый метионин не включался ни в одну из структурных единиц пептидной цепи. Обсуждаются возможные пути синтеза пептидных цепей.