Морфометрическая характеристика альвеолярных макрофагов - патология органов дыхания у ликвидаторов аварии на чаэс
К. Шарпен, А. Л. Черняев, О. М. Гробова
6
Морфометрическая характеристика альвеолярных макрофагов ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС в отдаленный период
Изучение жидкости бронхоальвеолярных лаважей (БАЛ) ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС (ЧАЭС), страдающих хроническими обструктивными заболеваниями легких, доказало присутствие в цитоплазме альвеолярных макрофагов многочисленных фаголизосом. Спектрометрическое изучение содержимого фагосом выявило присутствие элементов группы актинидов (Chuchalin A. et al., 1995). Очевидно, что присутствие подобных включений оказывает индуцирующее влияние на различные механизмы функционирования альвеолярных макрофагов (выработка цитокинов), ответственных за повреждение тканей бронхов и альвеол и активацию провоспалительных клеточных механизмов (Cryestal R. G., 1991). В предыдущих исследованиях выявлено, что альвеолярные макрофаги ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС активно секретировали интерлейкин-8 — мощнейший хематтрактант нейтрофилов (Chuchalin A. et al., 1995 б). Активация альвеолярных макрофагов может быть результатом изменения как количества, так и качества содержимого цитоплазмы макрофагов. В связи с этим представляется клинически целесообразным удалять подобные макрофаги из легких при помощи известных неинвазивных методов, к которым относится, в частности, БАЛ.
Целью настоящего исследования было изучение морфологических и денситометрических характеристик цитоплазматических включений альвеолярных макрофагов БАС ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, страдающих хроническим обструктивным бронхитом.
В исследование были включены больные с хроническим обструктивным бронхитом (16 мужчин, в возрасте от 30 до 46 лет). Всех больных беспокоил кашель со слизистой мокротой в большинство дней месяца на протяжении как минимум 3 месяцев в году в течение последних 5 лет. Рентгенологически у всех пациентов были обнаружены признаки эмфиземы и пневмосклероза. Критерии для включения пациентов в исследование были: а) отсутствие сведений о семейной предрасположенности к аллергическим заболеваниям- б) отсутствие других видов легочной патологии (бронхоэктазы, туберкулез легких, рак легкого)- в) обострение заболевания, проявляющееся усилением одышки, сопровождающееся изменением качества (слизистая на гнойную) и количества мокроты в последние 10 дней- в) длительный анамнез табакокурения (более чем 13 лет) и активное курение в настоящее время (10—20 сигарет с фильтром в день)- г) отсутствие профессиональных ингаляционных факторов, способствующих развитию патологии органов дыхания. Восемь из обследованных пациентов принимали участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС и работали на стройплощадке станции в 1986— 1987 годах. Все ликвидаторы проживали до и после аварии в районах России, не подвергавшихся радиационному поражению после аварии на ЧАЭС. Для всех ликвидаторов было характерно следующее: а) отсутствие субъективных и объективных признаков заболеваний легких до работы на стройплощадке ЧАЭС- б) работа на ЧАЭС в условиях запыленности (погрузка на машины частей разрушенных стен энергоблока, грунта)- в) отсутствие средств защиты органов дыхания (респираторы, защитные маски) во время работ. При поступлении пациентов в клинику НИИ пульмонологии МЗ РФ все они были обследованы при помощи общепринятых клинико-лабораторных методов исследования: анализ истории болезни, физикальное обследование, функциональное исследование органов дыхания, рентгенография, ЭКГ, клинический анализ крови. У всех пациентов были выявлены воспалительное сдвиги в крови. Функциональные легочные тесты (спирометрия и бодиплетизмометрия — 6200 Autobox, SensorMedics Согр.), выполненные на этом этапе, демонстрировали снижение показателя FEV, ниже 80% от должного- лучшие значения FEV/FVC после ингаляции бронхолитика были ниже 70% от должного. В зависимости от выявленных изменений как пациентам основной группы (ликвидаторам), так и пациентам группы сравнения (неликвидаторам) проводилась терапия теофиллином, бета- агонистами и антибиотиками. По окончании 7—14-дневной терапии пациенты были вновь обследованы при помощи методов, выполненных при поступлении в клинику (табл. 1).
Для определения степени выраженности воспалительных изменений в легких на этом этапе исследования была проведена фибробронхоскопия и БАЛ, выполненные по общеизвестным правилам (Joseph N. et al., 1980). Таким образом, пациентам основной группы (ликвидаторам) БАЛ проводили 8—9 лет спустя после работы на ЧАЭС и экспозиции радиационных аэрозолей. Всем пациентам фибробронхоскопическое исследование осуществляли под местной анестезией 2% раствором лидокаина гибким фиброскопом BF-B3 (Olympus Corp. of America, New Hyde Park, NY). После визуальной оценки состояния бронхов дробно, по 50 мл, вводили апирогенный подогретый до 37°С изотонический раствор NaCl, приготовленный для внутривенного введения. Общее количество введенной жидкости составляло 250 мл. В качестве материала для исследования использовали 2—5 порции. Для трансмиссионной электронной микроскопии клетки БАЛ фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4). Постфиксацию проводили 1 % раствором OsO4 на изотоническом фосфатном буфере (pH 7,2) в течение 60 минут- контрастирование — 2% водным раствором уранилацетата в течение 60 минут. Затем взвесь клеток БАЛ обезвоживали в ацетонах восходящей концентрации и заливали в эпоксидные смолы. 10 окрашенных уранилацетатом ультратонких срезов анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 1200 (Japan). Для достижения достаточного количества (3000—6000) анализируемых образцов цитоплазматических включений делали не менее 20 микрофотографий макрофагов БАС на одно наблюдение. Морфометрическое и денситометрическое изучение включений макрофагов осуществляли, как ранее описано, при помощи компьютеризированной программы — SAMBA 2005, Alcatel TITN, Grenoble, France (Brugal G., 1984). Анализ изображения цитоплазмы альвеолярных макрофагов проводили с черно-белых фотографий при помощи видеокамеры (Sony согр.) по 10 параметрам: показатель средней поверхности макрофага (в пикселях), среднее число фагосом на 1 макрофаг, показатель отношения поверхности фагосом к поверхности клетки, средний размер фагосом (в пикселях), фактор сечения фагосом, средняя оптическая плотность фагосом со светлым и темным содержимым (ранг измерения 0-255). Общий принцип морфометрической и денситометрической оценки был разработан и представлен ранее (Charpin С. et. al., 1988,1992,1995- Devictor В. et al., 1993).
БАС ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС содержала большое количество макрофагов. Альвеолярные макрофаги были увеличены в размерах, цитоплазматическая поверхность их имела многочисленные цитоплазматические ворсинки (рис. 1, а). Цитоплазма клеток содержала огромное количество включений, различных по размеру, форме и оптической плотности содержимого. Большинство цитоплазматических включений имели морфологические признаки либо фаголизосом, содержащих в большинстве наблюдений темный материал (очень похожий на выявляемый при антракосиликозе), либо иглоподобные тельца. Форма большинства фаголизосом была круглой, овальной или ангулярной (рис. 1, а- 2 а).
Электроннограмма альвеолярного макрофага (а, б), компьютерная морфометрия инородных частиц в фаголизосомах цитоплазмы (в), гистограмма распределения объемов инородных структур в цитоплазме (г).
а, б, в х 5000
Рис. 1, а.
Рис. 1, в.
Некоторые включения занимали около 1/3 клеточной площади. Некоторые фагосомы содержали кристалло- и миелиноподобные тельца. Большинство макрофагов имели признаки клеточной активации, меньшая часть клеток — признаки дистрофии. Вокруг клеток с нарушенной целостностью цитоплазматической мембраны или признаками лизиса цитоплазмы наблюдали свободно лежащие темные включения.
В БАС пациентов-неликвидаторов количество макрофагов было значительно меньше. Не удалось обнаружить включения, подобные описанным у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. Морфологические характеристики макрофагов соответствовали описанным для клеток в условиях нормы (Normand С. et al., 1987).
Результаты анализа изображения цитоплазматических включений альвеолярных макрофагов ликвидаторов в виде среднего значения на каждое наблюдение и показателя стандартного отклонения представлены в табл. 1, рис. 1 б-г- 2 б-г.
Аналогичный рисунок другого альвеолярного макрофага, а, б, в х 5000.
Рис. 2, б.
Рис. 2, в.
Рис. 2, г.
Таблица 1 Морфометрические и денситометрические показатели альвеолярных макрофагов БАС ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС(М ± ш)
Параметры | Показатели |
Размер AM, пиксели | 87651+7921 |
Общее количество фагосом | 45 827 |
Количество фагосом на 1 клетку | 77+34 |
Размер фагосом, пиксели | 387+543 |
Отношение поверхности фагосом | 23,7 |
к поверхности клетки, % | |
Отношение поверхности темных | 11,3 |
фагосом к поверхности клеток, % | |
Фактор профиля фагосом | 1,32±0,23 |
Фактор профиля темных фагосом | 1,32+0,23 |
Средняя оптическая плотность фагосом | 171+31 |
Средняя оптическая плотность | |
темных фагосом | 103±32 |
Альвеолярные макрофаги жидкости БАЛ ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС содержали значительное количество включений, которые были проанализированы при помощи компьютеризированной программы морфометрии и денситометрии.
Полученные результаты нельзя пока отнести к специфическим признакам радионуклидного пневмокониоза. Однако выявленные количественные показатели состояния цитоплазмы альвеолярных макрофагов позволят сопоставить их с динамическими клиническими и функциональными изменениями и четко определить диагностические признаки поражения легких вследствие радиационного поражения. Анализ изображения позволил объективным способом оценить огромное количество включений и в связи с высоким уровнем стандартизации исследования очень эффективен в клинических целях. Этот метод может быть использован, в частности, при оценке эффективности лечебных мероприятий, направленных на выведение из бронхоальвеолярного пространства частиц, ответственных за повреждение ткани легких. Настоящее исследование было посвящено морфометрической и денситометрической оценке альвеолярных макрофагов, полученных в ходе первичного диагностического БАЛ. Подобный объективный подход в дальнейшем позволит оценить эффективность повторных лечебных БАЛ в очищении легких от активированных макрофагов, содержащих инородный материал.
Включения, выявленные в альвеолярных макрофагах ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, могут быть цитологическим признаком пневмокониоза с повреждающим эффектом на ткань легких независимо от того, содержатся в них радионуклиды или нет. У обследованных нами пациентов официальная паспортизированная доза облучения колебалась от 16 до 23 рентген. В настоящее время не представляется возможным определить истинную дозу, полученную каждым ликвидатором, и, в частности, очень сложно рассчитать дозу, привнесенную ингаляцией радиоактивных аэрозолей. Тем не менее, проведенное нами ранее качественное спектрометрическое исследование цитоплазмы альвеолярных макрофагов выявило присутствие ряда химических элементов, входящих в состав топлива АЭС чернобыльского типа. В настоящее время наша исследовательская группа проводит изучение химического состава фагосом на ультратонких срезах, что позволит определить корреляционные отношения между морфометрическими, денситометрическими параметрами и химическим составом фагосом и выявить специфические цитологические признаки радиационного чернобыльского пневмокониоза.
Присутствие элементов группы актинидов может быть причиной нерадиационного повреждения клеток и изменений в легких. Последние могут быть обусловлены наличием нерадиоактивной многокомпонентной пыли в цитоплазме альвеолярных макрофагов. Огромное количество включений приводит к усилению функциональной активности этих клеток, проявляющейся увеличенной выработкой IL-8, мощного и специфического хематтрактанта нейтрофилов, который в свою очередь также активизирует функциональную активность нейтрофилов (Schroder J.M., Christopher, 1991). Наши исследования выявили значительное усиление активности миелопероксидазы нейтрофилов БАЛ у обследованной группы ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС (Grobova О. М. et al., 1994). Все эти данные могут быть доказательством афферентной активации клеток БАС и активного воспалительного процесса (альвеолита и бронхиолита) в легких ликвидаторов. Кроме того, присутствие элементов группы актинидов может оказывать определенные радиационно обусловленные повреждения генома эпителиальных клеток. В обследованной группе больных проводятся исследования, в частности, мутаций антионкогенов (р53) и состояния регуляции вс12 гена апоптоза. Подобные исследования, проводимые на материале биоптатов бронхов, позволят дать ответ о возможном риске развития рака легких и будут дополнительным аргументом для проведения программного объемного лаважирования легких данной группы пациентов.
ЛИТЕРАТУРА
Brugal G. Image analysis ofmicroscopic preparation // Methods and Achievement in Experimental Pathology/Ed. G. Jasmin, L. Proschek. — Basel: Karger, 1984. — P. 1—33.
Charpin C., Andrac L., Vacheret H. et al. Multiparametric evaluation (SAMBA) of growth fraction (monoclonal Ki67) in breast caroinoma tissues // Cancer Res. — 1988. — Vol. 48. — P. 4365—4374.
Charpin C., Bonnier P., PianaL. et al. Correlation of nucleolar morphometry assessed by automatic image analysis in breast cancer with aneuploidy, Ki67 immunostaining, histopathologic grade and lymph node involvment // Pathol. Res. Pract. — 1992. — Vol. 188. — P 1009—1017.
Charpin C., Devictor B., Amabile L. et al. P53 Quantitative immunocytochemicalanalysis in breast carcinomas // Hum. Pathol. — 1995. — Vol. 26. — P. 159—166.
ChuchalinA. G., Grobova 0., CherniaevA. et al. The delayed respiratory consequences of inhaled radionuclides in population exposed to nuclear catastrophe // STEM Cells. — 1995. — Vol. 113. — P. 2376-2382.
Chuchalin A. G., Grobova 0., Cherniaev A. et at. Long term effects of inhaled radionuclides on BAL // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1995. — Vol. 15, # 4. — P. A259.
Chuchalin A. G., Grobova 0., Chernikov V. et ai. Investigations of BAL fluid of the Chernobyl wreck&rsquo-s consequences on liquidators // Eur. Respir. J. — 1995. — Vol. 7, Suppl. 18. — P. 360s.
CryestalR. G. Alveolar macrophages // The Lung: Scientific Foundation /Ed. R. G. Cryestalet al. - New York: Raven Press, 1991. - P. 527-538.
Devictor B., Bonnier P., PianaL. et al. c-myc Protein and Ki67antigen immunodetection in patients with uterine cervix neoplasia: Correlations of microcytophotometric analysis and histological data // Gynecol. Oncol. — 1993. — Vol. 49. — P. 284—290.
Joseph N., Tonne A. B., Capron A. et al. Enzyme release and superoxide anion production by human alveolar macrophages with immunoglobulin // J. Clin. Exp. Immunol. — 1980. — Vol. 40. — P. 416-420.
Normand C., Cornu L., Wallaert B. et al. Etude ultrastructurale des cellules recoltees par lavage broncho-alveolaire dans la silicose et la pneumoconiose du mineur de charbon: correlation avec les caracteristiques cliniques de la maladies // Coll. INSERM. — 1987. — Vol. 155. — P. 99—108.
Schroder J. M., Christopher E. Secretion of novel and homolous neutrophil-activating peptides by LPS-stimulated human endothelial cells // Science. — 1991. — Vol. 142. — P. 244—251.
