Методы регистрации пепсино-, муцинообразующей и моторно-эвакуаторной функций желудка - язвенная болезнь желудка
Большое значение в оценке функциональной активности желудка при язвенной болезни имеет исследование в желудочном соке концентрации и дебита общего и активного пепсина (протеолитической активности).
Основные методы определения протеолитической активности желудочного сока основаны на определении его способности переваривать белковый субстрат — 2% раствор сухой плазмы (В. Н. Туголуков, 1965) или створаживающего действия на молоке (Н. П. Пятницкий, 1968). Эти методы являются хотя и легковоспроизводимыми и широкодоступными, но весьма неточными, поскольку на основании данных, полученных этими методами, можно судить лишь об общей переваривающей способности желудочного сока больного по сравнению со здоровыми, а не о концентрации и дебите фермента в желудочном соке. Наиболее точным в этом смысле является гемоглобиновый метод (J. Anson, М. Mirsky, 1932) и его модификация «П. М. Старицкой и Е. Г. Моргун (1972).
В основе метода лежит способность расщеплять полипептидную цепь гемоглобина с освобождением тирозина, количество которого прямо пропорционально концентрации в растворе активного пепсина. Концентрация тирозина определяется колориметрически по интенсивности окраски раствора.
Реактивы: кристаллический пепсин- 0,5% HCl- 2,5% хлористоводородный гемоглобин- 0,3 и. HCl- 0,3 и. ТХУ- 0,5 и. NaOH- реактив Фолина.
Приготовление гемоглобина: 1—2 л цитратной или дефибринированной крови крупного рогатого скота центрифугируют при 5000 об/мин. Плазму отсасывают. К осадку эритроцитов добавляют равный объем 1 % раствора NaOH, центрифугируют, отсасывают надосадочную жидкость. Центрифугируют 2 раза.
3. Определение количества гемоглобина в растворе
Масса кусочков бумаги, мг | Масса бумаги, смоченной раствором Hb, мг | Масса раствора Hb, мг | Масса сухой бумаги, мг | Масса сухого Hb, мг |
12 | 40 | 28 | 18 | 6 |
11 | 35 | 34 | 16 | 5 |
10 | 38 | 28 | 16 | 6 |
Масса раствора JHb 100 28—10
6—X
Х=21,4 %
Раствор гемоглобина содержит 21,4 % белка Hb. Хлорнстводородный Hb в 2,5 % концентрации готовят:
21,4 мл 2,5 % Hb.
Прибавляют 1/4 (по объему) 0,3 и. HCl. Получают 26,75 мл 2,5% хлористоводородного Hb.
Осадок эритроцитов помещают в целлофан и в холодную воду на сутки в холодильник. Происходит диализ. Раствор гемоглобина разливают во флаконы по 5—10 мл и замораживают. Размороженный раствор гемоглобина годен 1 день.
Определение концентрации гемоглобина: фильтровальную бумагу размером 10X10 см взвешивают на торзионных весах, смачивают раствором гемоглобина и опять взвешивают, накалывают на крючок и высушивают в сушильном шкафу в течение 10— 20 мин при 100сС. По разности массы влажной и сухой бумаги определяют количество гемоглобина в растворе (табл. 3).
Приготовление реактива Фолина по методу Фолина—Чиопалтеу. Титр 1,95—2,4. 1 мл раствора разводят водой до титра, затем прибавляют двойной объем Н20.
Ход реакции определения пепсина в желудочном соке. В широкие короткие пробирки вливают по 1 мл сока и по 2 мл 0,5% HCl. Инкубируют на водяной бане при температуре 25°С. Тут же инкубируют раствор 2,5% хлористоводородного Hb. Через 10 мин в каждую пробирку добавляют по 5 мл Hb и опять инкубируют 10 мин. Затем в каждую пробирку добавляют 10 мл 0,3 и. ТХУ, пробирки встряхивают и их содержимое пропускают через фильтровальную бумагу.
Параллельно ставят контроль. К 1 мл сока с 2 мл 0,5% HCl добавляют 10 мл 0,3 и. ТХУ и через несколько минут 5 мл раствора- встряхивают и фильтруют. Прозрачный бесцветный фильтрат в количестве 25 мл помещают в эрленмейеровскую колбу объемом 50 мл, добавляют 10 мл 0,6 и. NaOH и 3 мл реактива Фолина. Через 5 мин пробы и контроль колориметрируют на ФЭКе при красном фильтре в кювете объем 5 мм. От оптической плотности пробы отнимают оптическую плотность контроля. Количество пепсина определяют по калибровочной кривой в мкг на 1 мл сока.
Построение калибровочной кривой (табл. 4). Для. приготовления раствора пепсина 20 мг кристаллического препарата растирают в ступке с небольшим количеством 0,5% HCl, количественно переносят в мерную колбу и доводят 0,5% HCl до 100 мл. 1 мл такого раствора содержит 200 мкг пепсина.
Контроль аналогичен желудочному соку, вместо сока — 1 мл раствора- пепсина.
Пригоден только кристаллический (а не фармакопейный) пепсин, активность которого соответствует количеству пепсина в желудочном соке и не превышает количества белка в нем.
где Dp— дебит пепсина в миллиграммах, V — объем желудочного сока в миллилитрах- Р — концентрация пепсина в миллиграмм- процентах.
По нашим данным (И. И. Дегтярева. 1983- И. И. Дегтярева и соавт., 1983, 1987, 1992—1994- И. И. Дегтярева, В. Е. Кушнир, 1983), протеолитическая активность желудочного сока у здоровых людей колеблется при гистаминовой стимуляции от 10 до 20 мг%, составляя в среднем 16,4 мг%±0,55 мг%- при инсулиновой стимуляции концентрация активного пепсина в желудочном соке здоровых колеблется от 12 до 28 мг%, составляя в среднем 19,2 мг%±0,72 мг%.
У больных язвенной болезнью и с предъязвенным состоянием (хроническим первичным гастродуоденитом) средние цифры протеолитической активности желудочного сока превышают таковые у здоровых и составляют (25,7±1,6) мг% (пределы колебаний 12—60) при гистаминовой стимуляции и (23,7+1,03) мг% (пределы колебаний 15—68) при инсулиновой стимуляции желудочной секреции. У больных с предъязвенным состоянием протеолитическая активность желудочного сока в среднем равна (24,9± ±1,2) мг% (пределы колебаний 15—42) при гистаминовой стимуляции и (26,3 ±0,9) мг% (пределы колебаний 14—50) при инсулиновой стимуляции желудочной секреции.
Таким образом, как свидетельствуют наши данные, протеолитическая активность желудочного сока у больных язвенной болезнью и с предъязвенным состоянием повышена. Однако, как это видно из разброса абсолютных цифр концентрации активного пепсина желудочного сока у больных язвенной болезнью и с предъязвенным состоянием, при тяжелом течении язвенной болезни и язвенной болезни желудочной локализации абсолютные цифры протеолитической активности остаются в пределах нормы, а иногда даже несколько снижены.
Дебит протеолитической активности вичисляют по формуле:
При исследовании желудочного сока у больных язвенной болезнью многими авторами обнаружено повышение активности протеолитических ферментов. И. Л. Янсоне (1975) у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, сопровождающейся гиперацидностью желудочного сока, обнаружила повышение активности протеолитических ферментов до введения гистамина- после введения гистамина у больных с гиперсекрецией желудка, но без язвы протеолитическая активность резко возрастала, в то время как у больных с язвой она резко падала. По мнению автоpa, такое снижение активности желудочных ферментов можно объяснить увеличением количества секрета. Однако существует и противоположное мнение (J. Rudick, H. D. Jonowitz, 1974), что гистамин, так же, как гастрин, инсулин и холинергические стимуляторы, возбуждает кислотообразование и секрецию пепсина. Известно, что гастрин и гистамин стимулируют выработку пепсина в меньшей степени, чем секрецию HCl. При исследовании воздействия атропина на желудочную секрецию (И. JL Янсоне, 1975) выяснилось, что атропин снижает выделение секрета и HCl, но снижает протеолитической активности ферментов. Автор считает, что протеазы желудочного сока играют решающую роль в образовании пептических язв, поэтому нельзя не считаться с увеличением их активности и концентрации натощак, что может быть вредно для желудка. По данным этого автора, полученные натощак порции желудочного сока у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки обладают самой высокой протеолитической активностью по сравнению с таковыми у больных с выраженной гиперацидностью, но без язвы, а тем более у здоровых. Допускается также, что в желудке происходят качественные или количественные изменения спектра протеолитических ферментов (пепсинов). Некоторые исследователи признают возможность патологического изменения структуры самих протеолитических ферментов и изменения этих соотношений в их группах. Так, J. Rudick, Н. D. Jonowitz (1974) установили генетический полиморфизм пепсиногенов и связь с язвенной болезнью агрессивных пепсиногенов первой группы V фракции. По мнению авторов, это связано с недостаточностью простого аутосомного рецессивного гена. О появлении патологической формы пепсина, проявляющего свою активность при pH 7,4 (тканевое pH), сообщает в своих работах Н. Ш. Амиров (1974). Н. Veen, L. Hollinger (1947) считают, что нельзя не учитывать отщепление пептидов от молекулы фермента при переходе в активное состояние и пепсиноингибирующего их действия. Чем интенсивней происходит этот процесс, тем больше образуется натуральных ингибиторов желудочных протеаз, а именно: концентрация этих ингибиторов и определяет количество активных ферментов. В настоящее время существует также мнение (И. JI. Янсоне, 1975), что язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки с тяжелым течением не сопровождается высокой активностью желудочных протеаз. Автор объясняет это защитной реакцией, направленной на увеличение концентрации ингибирующих компонентов с целью исключения высокой концентрации протеолитической активности желудочного сока. Однако это предположение требует дальнейших доказательств, поскольку данные наших исследований (И. И. Дегтярева и соавт., 1982- И. И. Дегтярева, 1983- И. И. Дегтярева, В. Е. Кушнир, 1983- И. И. Дегтярева, И. Н. Старостенко, 1988- I. Degtjaryova и соавт., 1988, 1991, 1992- Н. В. Харченко, 1993), полученные при вычислении новых показателей (коэффициентов агрессивности пепсина и защиты желудочного сока), свидетельствуют о том, что даже сниженные абсолютные цифры протеолитической активности желудочного сока у больных язвенной болезнью и с предъязвенным состоянием являются крайне высокими для таких больных, поэтому в период рецидива и в межрецидивный период с целью профилактики обострений необходимо назначать препараты с антипептическим механизмом действия, связывающие активный пепсин в полости желудка и стимулирующие синтез защитных белков слизи покровными эпителиоцитами, поскольку желудочные муцины также связывают активную фракцию пепсина.
Протеолитическая активность, по мнению С. Н. David (1974), J. Rudick, Н. D. Jonowitz (1974), не всегда имеет определенный характер, поэтому не всегда представляет диагностическую ценность при язвенной болезни.
На клиническое значение пепсино-кислотных соотношений в желудочном содержимом при язве двенадцатиперстной кишки указывают Н. А. Скуя и А. Я. Данилос (1973). Авторы пришли к заключению, что у больных язвой двенадцатиперстной кишки в зависимости от тяжести клинического течения болезни наблюдаются различные соотношения кислото- и ферментовыделения. В начальных стадиях развития язвы двенадцатиперстной кишки наблюдается возбуждение ферментовыделительных клеток, что дает высокий базальный пепсино-кислотный индекс, имеющий диагностическое значение. Прогноз при уже диагностированной хронической язве двенадцатиперстной кишки у больных с малым базальным пепсино-кислотным индексом (ВПК) плохой. С помощью ВПК, по мнению авторов, можно прогнозировать клиническое течение язвенной болезни.
Данные Ц. Г. Масевича и В. А. Горшкова (1976) также свидетельствуют о том, что развитие язвенных дефектов желудка и двенадцатиперстной кишки связано с уровнем протеолитической активности желудка. Величина последней зависит от взаимодействия эндо-. и экзогенных факторов: объема, сокогонных и буферных свойств пищи, интенсивности и продолжительности секреторного ответа, скорости эвакуации содержимого желудка в двенадцатиперстную кишку, депрессорных влияний привратниковой пещеры (антрума) и двенадцатиперстной кишки на секреторную функцию желудочных желез. При изучении интрагастрального протеолиза авторы установили высокую протеолитическую активность желудочного сока при язвенной болезни, которая под влиянием лечения (атропина сульфатом, викалином) не всегда снижалась, а в 1/3 случаев даже повышалась. Такие данные указывают на необходимость фармакологической коррекции повышенной протеолитической активности антипептическими средствами.
Изучение интрагастрального протеолиза В. А. Горшковым (1977), Ц. Г. Масевичем и соавторами (1979) показало, что протеолитическая активность при язвенной болезни значительно выше, чем в извлеченном желудочном соке. Интрагастральный протеолиз при локализации язвы в желудке не отличается от контрольных показателей, при язве двенадцатиперстной кишки — превышает их как в пищеварительный, так и в межпищеварительный период.
Наибольшее различие в величине интрагастрального протеолиза у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и у здоровых выявляется при нормальной кислотности желудка. У больных язвенной болезнью ночной интрагастральный протеолиз преобладает над дневным.
Изучая топографию протеолитической активности желудка и двенадцатиперстной кишки, В. А. Горшков (1980) пришел к выводу, что можно выделить три зоны протеолиза: зону пептического гидролиза белка, переходную и зону триптического гидролиза белка. Первая соответствует телу желудка, переходная — антропилорическому отделу и начальному отделу двенадцатиперстной кишки и триптическая — гидролизу в двенадцатиперстной кишке.
Полученные данные имеют прямое отношение к пониманию патогенеза дуоденальных язв, происхождение которых принято связывать с увеличением кислотно-пептического воздействия на СО кишки. Значительная вариабельность на протяжении зоны пептического гидролиза белка у разных пациентов наводит на мысль, что при определении патологического состояния зона пептического гидролиза может смещаться в дистальном направлении, захватывая начальный отдел двенадцатиперстной кишки. Вследствие этого протеолитическая активность в области луковицы будет возрастать, приближаясь к таковой в теле желудка. В результате могут возникнуть условия для пептического повреждения СО двенадцатиперстной кишки, не обладающей устойчивостью к переваривающему действию пепсинов. Тем более, что гистохимически обнаружено уменьшение числа бокаловидных энтероцитов в СО двенадцатиперстной кишки и снижение секреции ими сиало- и сульфомуцинов, в результате чего снижаются адаптационные возможности СО двенадцатиперстной кишки и при повышении кислотности содержимого двенадцатиперстной кишки возникают условия для его повреждающего действия (JI. И. Аруин, В. С. Городинская, 1975).
К дополнительным диагностическим тестам, подтверждающим повышение пепсинообразовательной функции желудка, относится определение плазмо-, или гемопепсиногена биохимически или пепсиногена I RIA методом, а также уропепсиногена. Как известно, 99 % пепсиногена выделяется в просвет желудка, а 1%—в кровь и затем выводится с мочой. По данным А. В. Палия, В. П. Головченко (1973), плазмопепсиноген у больных язвенной болезнью был повышен в сравнении с контролем у 33 из 37 больных.
Количество уропепсиногена, по данным многих авторов, повышается (С. Д. Светова, 1970- В. И. Афаунова, 1968), что также свидетельствует о повышении количества ферментов в моче больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Однако прямой корреляции между выделением уропепсиногена и пепсинообразовательной функцией желудка не наблюдается, поскольку выделение этого фермента зависит от ренального фактора (суточного диуреза, функционального состояния почек), гормональных нарушений коркового вещества надпочечников (стероидные гормоны влияют на содержание пепсиногена в моче).
По данным некоторых авторов, при язвенной болезни уровень протеолитической активности желудочного сока колеблется в довольно больших пределах — от повышенных до нормальных и даже сниженных цифр (И. И. Дегтярева и соавт., 1983). Имеются данные (И. Л. Янсоне, 1975, и др.), что тяжелые формы язвенной болезни с выраженной клинической картиной заболевания (жестокая боль, диспепсические явления) иногда протекают на фоне пониженной протеолитической активности, т. с., по утверждению авторов, тяжесть заболевания не всегда коррелирует с повышенным протеолизом желудочного сока.
Мы полагаем, что столь разноречивые данные о колебаниях протеолитической активности и концентрации пепсина в желудочном соке обусловлены тем, что протеолитическая активность зависит от многих причин (локализации язвенного процесса, тяжести и давности заболевания и т. д.). Имеет значение также и то, что некоторые авторы, говоря о концентрации пепсина в единице объема желудочного сока, не учитывают, что на самом деле речь идет лишь об активной фракции пепсина, о которой они судят по его протеолитической активности. По-видимому, для суждения о способности железистого аппарата желудка выделять протеолитические ферменты необходимо учитывать не только протеолитическую активность желудочного сока, но и абсолютное (общее) выделение всех фракций пепсинов — активных и неактивных, а также определять их соотношение.
Для диагностики язвенной болезни можно применять и некоторые другие методы, которые позволяют эффективно изучать протективные свойства СО желудка и двенадцатиперстной кишки. Важное значение имеет состояние слизеобразующей функции желудка (А. А. Шептулин, В. X. Василенко, А. Л. Гребенсв, 1987).
Состав желудочной слизи и интенсивность ее секреции можно оценить с помощью определения в желудочном соке концентрации и общей продукции гликопротеинов. При этом большую роль играет изучение содержания в желудочном соке фукозы, участвующей в формировании вязкости вырабатываемой слизи и нейраминовой кислоты, обеспечивающей устойчивость слизи к протеолитическому действию желудочного сока.
В клинике акад. В- X. Василенко определяли содержание фукозы в желудочном соке цистеиновым методом, который основан на том, что производные продукты фукозы, соединяясь с гидрохлоридом цистеина, образуют вещества, дающие специфический спектр поглощения на спектрофотометре. Уровень нейраминовой кислоты изучался тиобарбитуровым методом, разработанным Н. Warren (1959), в котором специфический спектр поглощения давали вещества, образовавшиеся при взаимодействии производных сиаловых кислот с тиобарбитуровой кислотой. С помощью данного метода можно определить общую продукцию этих углеводных компонентов слизи и их концентрацию в желудочном соке, получаемом натощак, а также в базальных и стимулированных условиях (А. А. Шептулин, 1987). Было установлено, что у больных язвенной болезнью снижается концентрация фукозы и нейраминовой кислоты.
Особенно этот процесс был выражен при локализации язвы в желудке, у больных старших возрастных групп с тяжелым течением язвенной болезни, множественными язвами, злоупотребляющих алкоголем, перенесших желудочно-кишечное кровотечение и перфорацию язвы.
Таким образом, абсолютный и относительный дефицит - слизеобразования может быть фактором патогенеза язвенной болезни и неблагоприятно отражаться на течении заболевания.
Диагностика состояния слизеобразующей функции желудка у больных язвенной болезнью позволяет правильно оценить особенности патогенеза заболевания у данного больного даже при низкой секреторной активности желудка, выявить причины торпидного течения заболевания и частого рецидивирования язвы, рационально подойти к выбору лечебного комплекса противоязвенных средств, в состав которого следует включать репаративные препараты, стимулирующие синтез белков слизи в желудке.
О снижении слизеобразующей функции желудка и двенадцатиперстной кишки у больных язвенной болезнью можно судить на основании гистохимических методов исследования (В. М. Успенский, 1982).
И. М. Беловой (1986) установлено снижение содержания фукозы и гексоз, связанных с белком, в фазе обострения язвенной болезни и некоторое повышение в фазе ремиссии, что может играть определенную роль в ослаблении резистентности СО двенадцатиперстной кишки при язвенной болезни.
Существует мнение, что развитие язвенной болезни и ее течение связаны не столько с состоянием кислотообразовательной функции желудка, но и с соотношением между кислотностью и секрецией слизи, которая при язвенной болезни нарушается В. М. Успенский, 1982- S. Takemoto и соавт., 1982). Чаще на фоне повышенной или нормальной кислотности снижается продукция защитных компонентов слизи, в частности, ацетилнейраминовой кислоты (Е. Я- Скляров, 1980).
В настоящее время проводятся многочисленные исследования, посвященные нарушению синтеза компонентов желудочной слизи, способствующих язвообразованию (П. Д. Рабинович, Н. И. Домрачева, 1976- А. П. Линчевская, Д. Кан, 1980- P. D. Rabinowich, 1976).
По данным этих авторов, синтез гликопротеинов, особенно фукогликопротеинов, в СОЖ снижен, а также затруднен их выход в полость желудка из-за нарушения композиции углеводных ветвей. Все это приводит к истощению защитных механизмов, в результате чего уменьшается устойчивость СОЖ к агрессивному действию желудочных протеаз.
Ц. Г. Масевич и соавторы (1980), И. С. Синдаловская (1981) изучали влияние протеаз желудка и поджелудочной железы на слизистые вещества двенадцатиперстной кишки при дуоденальной язве. В результате установлено, что протеазы желудка оказывают более выраженное протеолитическое действие на сиаломуцины дуоденального содержимого у больных язвой двенадцатиперстной кишки по сравнению с контрольной группой. Протеазы поджелудочной железы оказывают более выраженное действие на гексозы дуоденального содержимого по сравнению с контрольной группой. Установлено также, что при воздействии определенного количества пепсина на дуоденальное содержимое при оптимальном ее действии (pH 2) концентрация слизистых веществ (сиаломуцинов) и количество белковых фракций уменьшено и более выражено у больных язвенной болезнью по сравнению со здоровыми. Все это свидетельствует о снижении резистентности слизистых веществ желудка и двенадцатиперстной кишки при язвенной болезни.
Белковый состав желудочного сока, в том числе и белки слизи, пепсины, альбумины, пептоны, обычно определяется методом электрофореза, диск-электрофореза в полиакриламидном геле, хроматографическим способом на ДЕАЕ-целлюлозе (И. Л. Янсоне, 1975- И. Е. Трубицина, Н. Ш. Амиров, 1977- И. С. Синдаловская, 1981- G. К. Glass и соавт., 1956, 1957) или с помощью диффузного высаливания (Н. В. Зеленский, 1959).
До настоящего времени в медицинской практике при исследовании белков жидкостей и тканей организма (кровь, желудочный сок, моча и др.) широко использовали метод электрофореза, предложенный Тизелиусом в 1937 г. G. К. Glass и соавторы (1956, 1957) расшифровали электрофореграмму белков желудочного сока. В бывшем СССР исследование белков желудочного сока методом электрофореза (на аппарате свободного электрофореза, дискэлектрофореза и др.) проводили при хроническом гастрите и язвенной болезни Н. Ш. Амиров и соавторы (1978), А. Г. Бараков и соавторы (1980), при раке желудка — Ф. М. Эйдельман (1964), И. В. Касьяненко и соавторы (1974), И. JL Янсоне (1975). С помощью этого метода был впервые определен белковый спектр желудочного сока, состоящий из пепсинов (Р), муцинов — белков слизи (М, 1—4), альбуминов и продуктов переваривания белков сока — пептонов (Х-, У-, Z-фракции). Метод позволяет качественно определять фракции белков желудочного сока и их изменения в зависимости от различных функциональных и патологических состояний желудка. Метод электрофореза имеет ряд недостатков, которые приводят к определенному проценту ошибок. Для исследования белков желудочного сока методом электрофореза необходимо проводить длительную трудоемкую обработку желудочного сока (диализ сока, лиофилизация, обработка ацетоном, концентрация на сефадексе и т. д.). При такой обработке вследствие агрегации могут изменяться физико-химические свойства белковых молекул (Ф. М. Эйдельман, 1964), и это может привести к извращению истинной информации о количественном и качественном составе белков желудочного сока.
Исследование белков желудочного сока методом электрофореза занимает несколько суток (диализ, концентрация, разгонка на аппарате, окраска, высушивание, денситометрирование или элюирование). Денситограммы также нуждаются в длительной обработке, прежде чем будут получены цифровые данные. Для анализа белков методом электрофореза необходимо предварительное повышение концентрации белка в растворе до грамм-процентов. Концентрация сока, а также высокий процент белков в исследуемом растворе ведут к слипанию (агрегации) белковых молекул, что затрудняет анализ показателей. Совершенствование лабораторных методов позволило устранить эти недостатки и определять белковый спектр методом хроматографического анализа и др.
В настоящее время широко используют новые усовершенствованные методы электрофореза (диск-электрофорез в ПАА-геле и хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе). В наших исследованиях мы пользовались высокоинформативным, удобным для применения в любой лаборатории и клинике методом диффузного высаливания белков, описанным Н. В. Зеленским (1959).
Метод диффузного высаливания белков применяли в единичных случаях для определения белков сыворотки крови и совершенно не использовали для исследования белков желудочного сока при каких-либо заболеваниях. А. Г. Загороднева и соавторы (1977) этим методом изучали белковый состав желудочного сока у здоровых людей.
Мы (И. И. Дегтярева, 1983- И. И. Дегтярева и соавт., 1983, 1985, 1987, 1994- И. И. Дегтярева, С. Н. Старостенко, 1988) впервые использовали метод диффузного высаливания белков желудочного сока с целью диагностики предъязвенного состояния, активной фазы язвенной болезни, а также для подтверждения перехода заболевания в стадию ремиссии и возможности коррекции лечебных мероприятий при язвенной болезни. Метод диффузного высаливания белков основан на свойстве белковых молекул дегидратироваться под влиянием раствора аммония сульфата. При этом различные белки высаливаются при различной концентрации аммония сульфата, что позволяет их разделять. Дегидратация белковой молекулы изменяет оптические свойства раствора, и эти изменения регистрируются на фотоэлектроколориметре, откалиброванном по белковым растворам определенной концентрации.
Определение белков методом диффузного высаливания по сравнению с определением белков общеизвестным методом электрофореза имеет ряд существенных преимуществ:
Возможность определения белков при концентрации их в растворе около 200—250 мг%. Благодаря этому можно исследовать нативный желудочный сок без предварительного концентрирования.
Быстрота получения информации: весь процесс анализа пробы сока (разливание раствора аммония сульфата, наслаивание сока, колориметрирование и вычерчивание кривой) занимает около 2 ч. Таким образом, через 2 ч после получения пробы сока можно узнать количественный и качественный состав находящихся в нем белков.
Более высокая, чем при электрофорезе, точность разделения белковых фракций. Малая концентрация белка в исследуемом растворе (200—250 мг%) исключает взаимодействие различных белковых молекул между собой. Необходимо отметить, что применяемые в последнее время для анализа белковых растворов методы разделения в полиакриламидных гелях также предусматривают концентрацию белков в исследуемом растворе не более 200—250 мг% (К. Davis, 1964). Только при такой концентрации белков, используя некоторые современные методы анализа белковых растворов, можно определить четкую границу между анализируемыми фракциями, что очень важно для суждения об их количественном и качественном составе. Автором метода диффузного высаливания белков Н. В. Зеленским (1959) и нами точность получения кривой оценивалась путем проведения двух параллельных анализов одного и того же раствора белков. Расхождение показаний между двумя кривыми было менее 5%, т. с. меньше допустимой в биологических исследованиях ошибки.
Возможность дополнительного определения коэффициентов агрессивности пепсина и защиты желудочного сока при диагностике предъязвенного состояния, активной фазы язвенной болезни и оценке лечебных мероприятий (при переходе заболевания в стадию ремиссии).
Точность и простота постановки, возможность применения в условиях лаборатории любого гастроэнтерологического и общетерапевтического стационара. Для диффузного высаливания не нужно специальной аппаратуры, кроме лабораторной посуды и фотоэлектроколориметра.
Исходя из того что немногочисленные работы (И. JT. Янсоне, 1975, и др.), посвященные изучению белкового состава желудочного сока при язвенной болезни, выполнены в основном с использованием метода электрофореза и результаты исследований позволяют судить лишь о качественных изменениях в белковых фракциях, в наших исследованиях использован простой, но информативный метод диффузного высаливания (Н. В. Зеленский, 1959), модифицированный для определения белков желудочного сока А. Г. Загородневой и соавторами (1977), позволяющий судить не только о качественных изменениях в белковом спектре (пепсинов, белков слизи и т. д.), но и оценить количественные отличия белковых фракций желудочного сока больных язвенной болезнью от таковых у здоровых лиц.
Использованный для определения белков желудочного сока метод диффузного высаливания белков опубликован давно, однако не получил широкого распространения, поэтому приводим краткое его описание.
Метод довольно прост, но с высокой точностью разделяет белки на фракции и определяет их количественный состав. Анализ состава белков в растворе по этому методу проводят следующим образом. В ряд пластмассовых стаканчиков объемом по 100 мл наливают 0,5 мл раствора аммония сульфата увеличивающейся концентрации — от 0 до 95%. На солевые растворы через тонкую иглу наслаивают по 0,5 мл раствора исследуемого белка. Раствор белка тонким слоем растекается по поверхности более плотного солевого раствора. В таком виде растворы закрывают и оставляют до 60 мин на антивибрационной основе при температуре 20— 21°С. Через поверхность раздела слоев происходит диффузия раствора, и белковые молекулы дегидратируются. Вследствие этого во всем объеме наслоенного раствора высаливаются белки и оптическая плотность раствора изменяется. Разные белки высаливаются при определенной степени насыщения аммония сульфата. На фотоколориметре ФЭК-М, заранее откалиброванном по раствору белков определенной концентрации, регистрируется степень светопропускания исследуемых растворов. Кривая диффузного высаливания имеет две калибровочные оси: вертикальная ось показывает концентрацию белков (% Б), горизонтальная — качественный состав белков и значение концентрации высаливателя (% В). Таким образом, диффузное высаливание дает возможность одновременно определять количественный и качественный состав белков.
При использовании этого метода пепсины высаливаются между 20 и 60% насыщения высаливателя (аммония сульфата). Максимальная точка подъема кривой на 60% насыщения высаливателя отражает количество всех пепсинов, находящихся в соке. В средней части шкалы — от 60 до 80% насыщения — высаливаются белки слизи и сывороточный альбумин, на последних точках насыщения высаливателя (после 80%)—полипептиды (продукты расщепления высокомолекулярных компонентов желудочного сока).
Прежде чем перейти к изложению собственных данных, следует обратить внимание на то, что в работах, посвященных изучению переваривающей способности желудочного сока, определяли активность пепсинов и на основании этого судили о концентрации пепсинов в соке. При таком подходе устанавливают не суммарное количество выделенных пепсинов, а лишь активную часть фермента. Определение обоих показателей общего суммарного пепсина (активного и неактивного количества фермента) и его активной фракции (протеолитическая активность) и их соотношений необходимо для оценки состояния желудочных желез и нарушения их деятельности у больных язвенной болезнью.
Нами установлено, что язвенная болезнь и предъязвенное состояние сопровождаются резким снижением во всех порциях сока (натощак, базальном и стимулированном гистамином и инсулином) количества общего белка в среднем на 50%, количества суммарных пепсинов (активных и неактивных) в среднем на 50%, равно как и других белковых фракций желудочного сока: белки слизи + альбумины — в среднем на 60%, пептоны—в среднем на 50%, что можно объяснить снижением при данном заболевании белковосинтетической функции СОЖ, катаболической направленностью процессов в ней, обусловленных нарушением нейротрофической регуляции с преобладанием парасимпатической импульсации и нарушением микроциркуляции в гастродуоденальной зоне. Полученные данные согласуются с результатами проведенных нами электронно-микроскопических исследований, свидетельствующих об усилении катаболических процессов, снижении синтеза белка и нарушении микроциркуляции при язвенной болезни, а также аминокислотного фонда СОЖ-
Полученные данные о выраженном снижении количества всех белковых фракций желудочного сока при язвенной болезни указывают на патогенетическое значение при этом заболевании сниженной способности СОЖ синтезировать белки, что необходимо учитывать при назначении лечебных мероприятий больным язвенной болезнью.
Еще большее снижение количества общего белка и его фракций во всех порциях сока (за исключением порции после инсулиновой стимуляции) установлено в остром наблюдении на фоне частичной фармакологической блокады блуждающего нерва, которую вызывали лекарственной комбинацией малых доз холиноблокаторов и спазмолитиков, часто применяемых, учитывая патогенез заболевания, в лечебных комплексах.
Несмотря на то что после курсового лечения больных язвенной болезнью холиноблокаторами установлена некоторая активация белковосинтетических процессов в СОЖ (по сравнению с активной фазой заболевания), уровень последних далеко не достигает нормальных величин, а в период максимально выраженного действия холиноблокаторов в остром наблюдении в какой-то период времени даже наблюдается угнетение белкового синтеза. Для стимуляции репаративных процессов в СО гастродуоденальной зоны в применяемые при язвенной болезни лечебные комплексы необходимо включать помимо антихолинергических, анаболические средства.
Обращает на себя внимание тот факт, что при инсулиновой стимуляции желудочной секреции у больных язвенной болезнью в остром наблюдении на фоне фармакологической блокады блуждающего нерва концентрации общего белка желудочного сока и отдельных его фракций не отличались друг от друга. Отсутствие снижения уровня общего белка и отдельных фракций белков желудочного сока у больных язвенной болезнью на фоне блокады блуждающего нерва при инсулиновой стимуляции можно объяснить выраженным анаболическим действием инсулина на белковый обмен- последнее перекрывает ингибирующее действие на синтез белка блокады блуждающего нерва. Полученные данные указывают на целесообразность включения препаратов анаболического действия, в частности, небольших доз инсулина, в лечебные комплексы, применяемые при язвенной болезни, особенно на фоне антихолинергических препаратов.
Несмотря на сложившееся мнение о том, что протеолитическая активность желудочного сока при язвенной болезни повышена, имеются данные, что язвенная болезнь может протекать на фоне нормальной или даже сниженной протеолитической активности.
Нами установлено, что у больных язвенной болезнью протеолитическая активность желудочного сока в порциях натощак, базальной и стимулированной гиетамином и инсулином в среднем была повышена, составляя от 33 до 54%, а ее дебит увеличен более чем в 2 раза. Еще большее увеличение протеолитической активности отмечено в остром наблюдении на фоне частичной фармакологической блокады блуждающего нерва (от 47 до 74%). Однако у части больных абсолютные цифры протеолитической активности оставались в пределах нормальных величин, а у некоторых были даже несколько снижены. Как уже отмечалось, концентрация суммарных пепсинов (активных и неактивных фракций) в желудочном соке больных язвенной болезнью, а также в остром наблюдении на фоне блокады блуждающего нерва была резко снижена (в среднем на 50—60%). Таким образом, нами установлено, что при язвенной болезни в активной фазе, а также в остром наблюдении на фоне фармакологической блокады блуждающего нерва зачастую увеличивалось количество активных пепсинов (иногда оно оставалось в пределах нормы или было несколько сниженным) при выраженном снижении количества общих пепсинов. Последнее проявляется резким увеличением у всех больных язвенной болезнью, а также в остром наблюдении на фоне фармакологической блокады блуждающего нерва в 2—3 и более раз выведенного нами коэффициента агрессивности пепсина (К4), представляющего собой отношение протеолитической активности (т. с. активной части пепсина) к общему его количеству. Следовательно, Ка показывает, какая часть из выделенных пепсинов находится в активном состоянии, а также косвенно указывает на снижение белковосинтетических процессов в СОЖ и концентрации факторов инактивации пепсина, в частности, белков слизи.
Известно, что превращение пепсиногена в пепсин в желудочном соке происходит под действием HCl, отщепляющей мелкие пептиды, которые обладают пепсиноингибирующим действием. Поскольку при язвенной болезни резко уменьшалось количество фракций пепсинов, то и концентрация пептидов невелика, а ее величина, в известной степени, определяет пепсиноингибирующий эффект. Количество белков слизи, связывающих часть активного пепсина, при язвенной болезни также снижено. Если учесть оба этих фактора, то становится понятным, что, несмотря на общее низкое содержание пепсинов в желудочном соке, большая часть его находится в активном состоянии. У здоровых же, как показали результаты наших исследований, протеолитической активностью обладает лишь 1/3 выделенного пепсина.
Проведенные нами исследования желудочного сока у больных хроническим гастритом, сопровождающимся пониженной кислотной продукцией желудка, а иногда и гистаминрезистентной ахлоргидрией, показало, что у них также наблюдалось снижение в желудочном соке количества суммарных пепсинов в среднем на 32%, при резком угнетении протеолитической активности в среднем на 74%. Все это приводило к выраженному уменьшению (в 3—4 раза) по сравнению со здоровыми Ка пепсина.
При исследовании протеолитической активности, количества общих пепсинов и Ка пепсина у больных с предъязвенным состоянием были обнаружены те же изменения, что и у больных язвенной болезнью: повышение протеолитической активности желудочного сока (от 30 до 60%) на фоне выраженного снижения суммарного количества пепсинов в среднем на 58%, что приводило к резкому увеличению Ка пепсина — в 2,9—3,7 раза по сравнению с нормой. Следует отметить, что если протеолитическая активность желудочного сока в активной фазе язвенной болезни повышалась, то протеолитическая активность у больных язвенной болезнью в стадии неполной ремиссии и у здоровых часто находилась на одинаковом уровне и не представляла диагностической ценности. Количество же пепсина при язвенной болезни резко снижено как в активной фазе заболевания, так и в стадии ремиссии. Ка пепсина как в активной фазе заболевания, так и, в меньшей степени, в стадии ремиссии повышен по сравнению с аналогичными величинами у здоровых. Таким образом, если протеолитическая активность не может служить надежным критерием диагностики язвенной болезни, то определение количества пепсинов и вычисление Ка пепсина является довольно четким показателем, способствующим постановке диагноза. Определение Ка пепсина и общего количества пепсина повышает точность диагностики язвенной болезни по сравнению с определением плазмопепсиногена на 34%, протеолитической активности — на 33%, кислотообразующей функции — на 31 %.
Обращает на себя внимание тот факт, что у обследованных нами больных язвенной болезнью кислотность была увеличена в среднем в 1,6 раза, протеолитическая активность — в 1,4 раза, плазмопепсиноген — в 1,45 раза, в то время как количество пепсина желудочного сока было уменьшено в среднем в 2,1 раза, а Ка пепсина увеличен в среднем в 3 раза. У многих больных в стадии ремиссии величина протеолитической активности и плазмонепсиногена снижалась до нормы, а К а пепсина, несмотря на тенденцию к снижению по сравнению с аналогичными величинами в активной фазе заболевания, часто оставался повышенным. Поэтому определение Ка пепсина является дополнительным лабораторным методом, способствующим диагностике язвенной болезни в обеих фазах — в период обострения и в период ремиссии. По динамике изменений Ка пепсина можно судить о переходе активной стадии заболевания в стадию ремиссии.
В результате проведенных нами электронно-микроскопических исследований установлено, что в СОЖ, наряду с клетками в гиперфункциональном состоянии, имеется большое количество клеток в умеренном функциональном состоянии. В главных клетках в большом количестве встречались сплошные секреторные поля вместо отдельных пепсиногенных гранул, а в секреторных гранулах ламеллярные, миелиноподобные и паракристаллические структуры, которые, по-видимому, ответственны за нарушение физико-химических свойств и дегенеративные изменения пепсиногена внутри гранулы, нарушения секретирования главными клетками. Все это может повлечь за собой уменьшение фракции суммарных (общих) пепсинов в желудочном соке.
Нами выведен также коэффициент защиты желудочного сока (Кз), представляющий собой отношение количества белков слизи к протеолитической активности.
Учитывая данные исследований, свидетельствующих о резком снижении количества белков слизи и о повышении протеолитической активности желудочного сока у больных язвенной болезнью и с предъязвенным состоянием, становится очевидным, что коэффициент защиты (К3 ) желудочного сока у этих больных резко снижен. Так, у здоровых этот коэффициент равен, в среднем 2,82+0,08, у больных язвенной болезнью — 0,43±0,07, у больных с предъязвенным состоянием — 0,52+0,08. Таким образом, если соотношение агрессивных и защитных факторов (Ка /Кз ) в полости желудка здоровых равно 0,1, то у больных язвенной болезнью оно равно 1,8, а у больных с предъязвенным состоянием — 2,3.
Таким образом, при язвенной болезни и предъязвенном состоянии на основании вычисленного Ка/К.3 можно говорить о преобладании факторов агрессии над защитой в 18—23 раза.
Таким образом, результаты проведенных нами исследований показали, что нередко как при повышенной, так и при сниженной кислотности, также как при повышенной, нормальной, а иногда и несколько сниженной протеолитической активности Ка пепсина при язвенной болезни и предъязвенном состоянии резко повышен, а К3 — резко снижен. Даже при нормальной или несколько сниженной протеолитической активности желудочного сока у больных язвенной болезнью и значительно повышенном при этом Ка, пепсина за счет резкого снижения количества суммарных пепсинов, отражающего общее угнетение синтеза белков в СОЖ, можно говорить о повышенном протеолизе в полости желудка и выраженной агрессивности этого процесса. Снижение протеолитической активности в желудочном соке у больных язвенной болезнью на фазе повышенного Ка пепсина свидетельствует о резко катаболической направленности белковосинтетических процессов в СОЖ, приводящей к снижению синтеза пластических и специфических белков (в.том числе и протективных белков слизи), к легкой ранимости клеток, относительно большой концентрации активных желудочных протеаз (для такого больного нормальные или несколько сниженные абсолютные цифры протеолитической активности являются высокими), поэтому даже на фоне невысокой концентрации активных пепсинов необходимо включать в лечебный комплекс препараты антациды и антипептики. Установлено, что прогноз заболевания при сниженной протеолитической активности и высоком Ks пепсина желудочного сока ухудшается.
То же можно сказать о К3 желудочного сока. На фоне повышенной,- сохраненной и даже сниженной протеолитической активности наблюдается резкое снижение Кз желудочного сока за счет уменьшения продукции защитных белков слизи, что является также отражением угнетения общей белковосинтетической функции СОЖ и ее резистентности.
Полученные данные о снижении общего количества белка желудочного сока и отдельных его фракций (пепсинов, белков слизи + альбуминов, пептонов) на фоне повышения, а в некоторых случаях незначительного снижения протеолитической активности и резкого повышения Ка пепсина и снижения Кз при язвенной болезни позволяет сделать заключение о патогенетическом значении полученных данных. В связи с выраженностью агрессии в полости желудка со стороны протеолиза целесообразно включать в любой лечебный комплекс препараты антацидного и антипептического действия, способствующие снижению протеолитической активности в желудке (типа фосфалюгеля, топалкана), и препараты анаболического действия, стимулирующие белковый синтез в СОЖ как пластических, так и специфических белков слизи.
Таким образом, на фоне традиционной терапии больных язвенной болезнью, включающей холиноблокаторы, спазмолитики, антациды и др., необходимо применять препараты антипептического действия и стимуляторы репаративных процессов (белкового синтеза), поскольку, как следует из данных И. Л. Янсоне (1975), Ц. Г. Масевича, В. А. Горшкова (1976), атропин не только не снижает ферментовыделительную функцию желудка у больных язвенной болезнью, но у 1/3 из них увеличивает ее. Эти данные вполне согласуются с полученными нами. Комбинация лекарственных средств, направленная на снижение тонуса блуждающего нерва, в остром наблюдении еще больше, чем в активной фаз? язвенной болезни, снижает общее количество белка и его фракций и приводит к еще большему повышению величины Ка пепсина. Поэтому на фоне традиционных холинолитических смесей, применение которых в связи с повышенным тонусом блуждающего нерва при язвенной болезни оправдано, также можно рекомендовать включать в комплексную фармакотерапию антациды, антипептики и стимуляторы белкового синтеза.
Полученные нами данные об идентичности изменений, концентрации общих, активных фракций пепсина, К а пепсина и К3 желудочного сока при предъязвенном состоянии и язвенной болезни обеих локализаций согласуются с данными клинического анализа, эндоскопического, электронно-микроскопического исследования гастродуоденальной зоны, свидетельствующими об однонаправленности нарушений, но разной степени их выраженности у больных с предъязвенным состоянием и язвенной болезнью. Все сказанное позволило нам рассматривать предъязвенное состояние (хронический первичный гастродуоденит) не как предболезнь, а как начальную предъязвенную стадию язвенной болезни.
Остановимся более подробно на возможности применения Ка пепсина и К3 желудочного сока в практическом здравоохранении.
Существует целый ряд методов определения протеолитической активности желудочного сока, среди которых наиболее распространенными являются методы Н. П. Пятницкого (1968) по-створаживающему действию желудочного сока на молоко- метод В. Н. Туголукова (1965) по переваривающему действию желудочного сока на сухую плазму и гемоглобиновый метод Ансона—Мирского (1932) в модификации А. М. Старицкой и Е. Г. Моргун (1972), основанный на образовании под влиянием активного пепсина желудочного сока тирозина, определяемого колориметрически.
Несмотря на то что последний метод отличается высокой точностью и информативностью, при его постановке могут возникнуть трудности, связанные с приготовлением и хранением растворов гемоглобина, необходимостью пользоваться сложными реактивами. Поэтому, учитывая большую ценность Ка-пепсина и К3 желудочного сока для диагностики язвенной болезни, мы сочли целесообразным сравнить данные величины протеолитической активности, Ка пепсина и К3 желудочного сока с результатами использования более простого, широко распространенного, легко воспроизводимого метода В. Н. Туголукова (1965).
Белковый состав желудочного сока в этой части исследования мы также определяли методом диффузного высаливания белков (Н. В. Зеленский, 1959).
Способ определения протеолитической активности желудочного сока по Туголукову включает забор желудочного сока, воздействие желудочного сока, содержащего протеолитический фермент, на белковый субстрат (раствор сухой плазмы), осаждение непереваренного белка с помощью трихлоруксусной кислоты и определение степени переваривания субстрата по разнице в объеме осадка в опытном и контрольном образцах. В целях установления зависимости степени переваривания от концентрации пепсина в желудочном соке использован фармакопейный (аптечный) пепсин. С помощью этого пепсина выведена калибровочная кривая и составлена рабочая таблица для перерасчета показателей переваривания на содержание пепсина в исследуемом материале, выраженное в грамм-процентах стандартного (фармакопейного) пепсина.
Известен также метод определения протеолитической активности желудочного сока по Ансону—Мирскому в модификации Л. М. Старицкой и Е. Г. Моргун, заключающийся в воздействии желудочного сока, содержащего активный пепсин, на белковый субстрат — гемоглобин, денатурированный HCI. Нерасщепленный белок осаждается с помощью трихлоруксусной кислоты, а количество продуктов расщепления определяется фенольным реактивом Фолина. Калибровка проводится кристаллическим пепсином, результаты выражаются в миллиграмм-процентах активного пепсина.
Как уже отмечалось, метод Ансона—Мирского отличается высокой точностью и информативностью, его используют для вычисления Ка пепсина, предложенного нами (И. И. Дегтярева и соавт., 1983) и имеющего большое диагностическое значение при язвенной болезни.
Однако, как было указано выше, этот метод малодоступен для широкого применения в лабораториях районных больниц, общетерапевтических стационаров.
В то же время метод определения протеолитической активности по Туголукову прост, легко воспроизводим, не требует дорогостоящих реактивов и аппаратуры, его можно широко применять в обычных лабораториях, в том числе районных больниц. Однако величины пепсина, полученные с помощью данного метода, в 120— 200 раз превышают показатели, полученные с помощью метода Ансона—Мирского, и поэтому отражают не действительное содержание пепсина в желудочном соке, а лишь его общую переваривающую способность.
Концентрация пепсина (одной из фракций белка желудочного сока) в 12—48 раз превышает количество общего белка желудочного содержимого, что невозможно. Из-за указанного недостатка использовать метод Туголукова для подсчета Ка пепсина и К3 желудочного сока невозможно.
С целью повышения точности диагностики язвенной болезни для определения протеолитической активности по В. Н. Туголукову при построении калибровочной кривой используют не фармакопейный пепсин, содержащий лишь 0,8—1% активного фермента- а высокоактивный стандартный кристаллический (И. И. Дегтярева и соавт., 1986- И. И. Дегтярева, И. Н. Старостенко, 1988-
И. Н. Старостенко, 1988), активность которого в 120 раз выше активности фармакопейного пепсина (П. М. Бабаскин, 1965).
Это осуществляется следующим образом. Приготавливают серии растворов с различной концентрацией стандартного кристаллического пепсина (от 10 до 5000 мкг/мл). В градуированные центрифужные пробирки помещают по 1 мл каждого раствора пепсина и по 2 мл 2% раствора сухой плазмы. Для контроля на каждые 3 пробирки с раствором пепсина ставят 1 пробирку с 1 мл воды. Штатив с пробирками помещают в термостат на 20 ч, затем в каждую из них вводят по 2 мл 10% трихлоруксусной кислоты, центрифугируют и определяют величину осадка в пробирке. Вычисляют показатель переваривания (М) по формуле:
где А — величина осадка в контроле, В — объем осадка в опыте.
На основании полученных результатов выводится кривая зависимости показателя переваривания белкового субстрата (М) от содержания стандартного кристаллического пепсина в 1 мл раствора. Эта кривая позволяет составить рабочую таблицу для пересчета показателя переваривания на содержание пепсина в исследуемом материале, выраженное в микрограммах на миллилитр стандартного пепсина.
После построения калибровочной кривой приступают к определению протеолитической активности желудочного сока. Для этого берут 1 мл профильтрованного, разведенного в 100 раз водой желудочного сока, помещают в градуированную центрифужную пробирку (опыт). В другую градуированную пробирку помещают 1 мл прокипяченного разведенного желудочного сока (контроль). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 2 ч. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 10% трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 мин. Определив величину осадка в опытном и контрольном образцах, вычисляют показатель переваривания субстрата по указанной выше формуле. По данным калибровочной таблицы производят пересчет его на содержание активного фермента в исследуемом соке, выраженное в мкг/мл стандартного кристаллического пепсина.
Далее вычисляют Ка пепсина, представляющий собой отношение протеолитической активности к общему количеству пепсинов желудочного сока, и Кз, представляющий собой отношение концентрации белков слизи к протеолитической активности.
Больной Д1, 45 лет, история болезни № 11392, поступил в клинику 18.08.83 г. с диагнозом: язвенная болезнь в стадии обострения, язва луковицы двенадцатиперстной кишки.
Взят для исследования желудочный сок, полученный в условиях базальной секреции. Дебит-час HCl — 3,2 мэкв (норма —2,6). Концентрация общего пепси
на (активного и неактивного), определенная методом диффузного высаливания, 25,2 мг %, или 252 мкг/мл (норма 43,5 мг %, или 434,6 мкг/мл).
Концентрация белков слизи — 24,4 мг %, или 244 мкг/мл (норма 52,8 мг %, или 528 мкг/мл).
Протеолитическая активность (по Туголукову) — 22 000 мкг/мл , или 2200 мг% (норма—1700 мг %, или 17 000 мкг/мл). Ка пепсина и К-r желудочного сока подсчитать невозможно, так как концентрация активного пепсина во много раз превышает общее количество пепсина и концентрацию белков слизи.
Протеолитическая активность по нашему методу 220 мкг/мл, нли 22 мг % (норма—172,8 мкг/мл, или 17,3 мг%).
Преимущество предлагаемого метода заключается в том, что он позволил приблизить метод Туголукова к наиболее точному определению концентрации активного пепсина по методу Ансона— Мирского в модификации Л. М. Старинкой и Е. Г. Моргун, отражающему истинное содержание активного фермента в желудочном соке.
Так, у здоровых протеолитическая активность в порции желудочного сока натощак по В. Н. Туголукову в нашей модификации— (186,2+13,0) мкг/мл, или 18,6 мг%- по Ансону—Мирскому— (154,2±8,4) мкг/мл, или 15,4 мг%- в базальном секрете по Туголукову— (172,8+12,6) мкг/мл, или 17,3 мг%- по Ансону- Мирскому— (148,4+9,6) мкг/мл, или 14,8 мг%- после стимуляции гистамином по Туголукову— (210,5± 15,3) мкг/мл, или 21 мг%- по Ансону—Мирскому — (179,7± 11,5) мкг/мл, или 17,9 мг%.
У больных язвенной болезнью протеолитическая активность желудочного сока натощак по методу Туголукова в нашей модификации составляет (269,2+16,5) мкг/мл, или 26,9 мг%- по Ансону—Мирскому—(201,5+9,2) мкг/мл, или 20,1 мг%- в базальной порции — (258,5+13,4) мкг/мл, или 25,8 мг% (по Туголукову), и (210,6+10,3) мкг/мл, или 21,0 мг% (по Ансону—Мирскому)- в гистаминовом соке—(312,6+16,8) мкг/мл, или 31,3 мг% (по Туголукову), и (305,8± 10,4) мкг/мл, или 30,6 мг% (по Ансону— Мирскому).
Некоторое отличие цифровых данных мы объясняем относительной неточностью метода Туголукова по сравнению с методом Ансона—Мирского, связанной, вероятно, с невозможностью стандартизировать субстрат (сухую плазму) визуальной оценкой количества непереваренного белка.
Таблица 6 Протеолитическая активность желудочного сока у здоровых и больных язвенной болезнью
Примечание: 1— здоровые лица (контрольная группа), 2 — больные язвенной болезнью.
Модификация способа Туголукова (И. И. Дегтярева, И. Н.Старостенко, 1985, 1988) позволила также использовать его для вычисления Ка пепсина и К3 желудочного сока, имеющих важное диагностическое значение при язвенной болезни как в фазе обострения, так и в стадии ремиссии заболевания.
Ка пепсина у здоровых в желудочном соке натощак с использованием модифицированного метода Туголукова составляет 0,42 ±0,06- по Ансону — Мирскому — 0,32±0,09- в базальном секрете этот коэффициент равняется 0,39 ±0,05 по Туголукову и 0,31 ±0,07 — по Ансону—Мирскому- в гистаминовом соке — 0,37+0,05 и 0,33 ±0,08 соответственно.
У больных язвенной болезнью К s пепсина в желудочном соке натощак по Туголукову— 1,05 ±0,08 и по Ансону—Мирскому — 0,84+ ±0,08, в базальном секрете—1,15+0,07 и 0,92±0,06- в гистаминовой порции — 0,82±0,06 и 0,80 + 0,06 соответственно.
К3 желудочного сока у здоровых натощак составляет по Туголукову 3,60+ 0,20 и по Ансону—Мирскому—4,38+0,23- в базальной секреции соответственно 3,12 ±0,21 и 3,48+0,18- после введения гистамина — 2,56±0,19 и 3,24±0,2.
Таблица 7. Протеолитическая активность, концентрация пепсина и Ка пепсина у здоровых и больных язвенной болезнью (с использованием метода В. Н. Туголукова)
Примечание: 1 — практически здоровые лица, 2— больные язвенной болезнью.
У больных язвенной болезнью Кз натощак по Туголукову — 1,2 ± 0,09 и по Ансону—Мирскому — 1,52±0,10- в базальном секрете — соответственно 1,0+0,08 и 1,15±0,09- в гистаминовом соке — 1,04+0,07 и 1,05 ±0,09 (табл. 6, 7).
Таким образом, изменения Кй пепсина и Кз желудочного сока, полученные с помощью метода В. Н. Туголукова с использованием вместо фармакопейного кристаллического пепсина, имеют абсолютно идентичную направленность с данными, полученными нами с использованием метода Ансона—Мирского. Простота и доступность этого метода, а также идентичность результатов, полученных при применении двух способов определения протеолитической активности, Ка и Кз позволяют широко использовать метод Туголукова в практическом здравоохранении, даже на уровне районной больницы, для определения агрессивных и защитных факторов желудочного сока и их соотношения у больных язвенной болезнью (табл. 8).
В ряде случаев язвенной болезни (особенно при низкой кислотной продукции) определенное диагностическое значение приобретает и исследование активной секреции гидрокарбонатов поджелудочной железы с применением секретин-панкреозиминового теста (или с использованием церулеина).
Таблица 8 Ка пепсина и Кэ желудочного сока и их соотношение у здоровых и больных язвенной болезнью (по методу Ансона — Мирского)
Примечание: 1— практически здоровые лица, 2 — больные язвенной болезнью.
Сниженная выработка гидрокарбонатов, например, у больных хроническим панкреатитом, может отрицательно сказываться на течении язвенной болезни и требует коррекции лечения (В. X. Василенко и соавт., 1987).
