Методы поиска биологически активных противоэпилептических веществ - фармакологическая регуляция психических процессов

МЕТОДЫ ПОИСКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОЭПИЛЕПТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ
Несмотря на довольно большой арсенал имеющихся антиконвульсантов, потребность в новых противоэпилептических средствах еще очень велика в связи с недостаточной эффективностью, частотой токсических и побочных эффектов имеющихся препаратов.
Задачи современной фармакологии и нейрофизиологии в области эпилепсии могут быть сформулированы следующим образом:

1. поиск новых, более эффективных и менее токсичных средств по сравнению с имеющимися лекарственными препаратами;
2. создание препаратов с избирательным действием в отношении определенного типа пароксизмов, приступообразных и постоянных психопатологических расстройств эпилептического генеза;
3. исследование молекулярно-биологических механизмов действия известных и новых лекарственных препаратов и на этой основе разработка научно обоснованных методов их поиска в эксперименте и клинике;
4. изучение фармакокинетики противоэпилептических средств, определение эффективных концентраций каждого препарата и учет этих данных при определении разовых и суточных доз, длительности курсов лечения;
5. выявление различий в эффектах и механизмах противоэпилептического действия разных групп препаратов для определения места каждой группы в комплексном лечении эпилепсии.

Вопрос экспериментального поиска противоэпилептических препаратов является одним из наиболее разработанных в фармакологии.
Это связано с тем, что уже в конце прошлого столетия довольно успешно разрабатывались экспериментальные модели эпилепсии. Начиная с работ А. Д. Сперанского по электрическому раздражению мозга, экспериментальная патофизиология, фармакология накапливали опыт создания моделей эпилепсии. С этой целью использовались раздражение различных областей мозга электрическим током, разные химические агенты, вызывающие судороги при введении в организм или аппликации на чувствительные участки мозга. Описано огромное количество судорожных ядов, действующих по разным механизмам на мозг и вызывающих типичные изменения нейронной активности, биоэлектрической активности мозга, судорожные припадки.
Swinyard [1949], Chen с соавт. [1954] предложили наборы тестов для отбора противосудорожных средств. С тех пор электрошок постоянно используется для создания модели больших эпилептических припадков и отбора противосудорожных препаратов по их  способности предупреждать тонико-экстензорную фазу электросудорожных припадков. В качестве модели малого эпилептического припадка чаще всего используется коразоловая модель судорог, хотя в зависимости от дозы и способа введения коразол может вызывать и нарушения, характерные для малого припадка с его  электрофизиологическим коррелятом пик-волна, и сдвиги, типичные для больших генерализованных судорог.
Несмотря на довольно большую историю вопроса, до сих пор нет единства в выборе методов поиска противоэпилептических препаратов, каждая лаборатория применяет свой набор методов или один метод, а его выбор при этом обычно не обоснован. В имеющихся методических рекомендациях [Саратиков, 1977] перечислены методы, которые могут в полной мере характеризовать на этапе доклинических экспериментальных исследований препарат с выраженной противосудорожной активностью- вопросы поиска, первичного отбора веществ с противоэпилептической активностью в них не обсуждаются.
В то же время, с нашей точки зрения, чрезвычайно важно различать последовательные этапы исследования в процессе поиска новых противосудорожных средств. Необходимо также найти такие методические подходы, которые позволили бы не только выявить новое вещество с противосудорожными свойствами, но и разделить группы противоэпилептических препаратов по основному механизму действия. Достижения нейрофизиологии делают эту задачу осуществимой. А это позволяет в последующем более четко определить показания для клинического применения каждой группы препаратов, выявить ее роль в лечении тех или иных эпилептических расстройств.
В 1980 г. Koela предложил набор тестов для первичного и углубленного исследования антиконвульсантов. На этапе первичных испытаний авторы используют следующие судорожные агенты для создания модели эпилепсии: максимальный электрошок- коразол, пикротоксин- стрихнин.
На этапе углубленных испытаний для моделирования малых припадков предложено использовать коразол и электростимуляцию белого вещества сенсомоторных областей мозга, для моделирования психомоторных припадков — электрораздражение гиппокампа.
Eadie, Tyrer [1983] рекомендуют следующие модели эпилептических синдромов, адекватные клиническим проявлениям эпилепсии

Проведенные исследования механизмов действия противоэпилептических препаратов, апробация различных методов оценки противосудорожных средств дают основания для рекомендаций по методам поиска этой группы препаратов.

Этапы изучения новых биологически активных средств

Как уже упоминалось, после поступления новых химических соединении они проходят несколько общих и частных этапов исследования. Для противоэпилептических препаратов это следующий порядок изучения:                                                     1) регистрация нового химического соединения;

1.  анализ его структуры и прогноз биологической активности;
2. первичное изучение психотропных и противосудорожных свойств;
3.  углубленное исследование противоэпилептических свойств на различных моделях судорожного синдрома- 5) выявление принадлежности нового активного соединения к определенной группе противоэпилептических препаратов по основному механизму действия- 6) сквозные испытания препарата с целью выявления их фармакологических и побочных эффектов- 7) изучение безопасности нового потенциального противоэпилептического препарата по программе, предусмотренной требованиями Фармакологического комитета- 8) исследование фармакокинетики препарата- 9) клинические испытания потенциального противоэпилептического препарата- 10) исследование тонких механизмов его действия.

Организация и проведение первичных испытаний химических соединений на противосудорожную активность

Первичное изучение противосудорожной активности веществ имеет целью ответить на следующие вопросы: 1) обладает ли данное вещество противосудорожной активностью- 2) примерно определить степень выраженности этой активности- 3) решить, целесообразно ли дальнейшее углубленное или уточняющее исследование противосудорожных свойств вещества
Первичное изучение противосудорожных свойств новых химических соединений проводится нами одновременно с выявлением потенциальных психотропных свойств, как описано выше.
Представляется целесообразным совместное применение методов выявления психотропных видов активности и противосудорожной активности по следующим соображениям. Психотропные и противосудорожные свойства веществ близки и постоянно переплетаются в спектре действия как психотропных, так и противоэпилептических средств
Как уже подчеркивалось выше, противосудорожные свойства имеются у некоторых нейролептиков, антидепрессантов, они постоянны у транквилизаторов. В то же время в структуре действия
большинства противосудорожных препаратов представлены седативные, транквилизирующие свойства. Поэтому обнаружение в процессе такого комплексного изучения седативных свойств у нового вещества является прогностически важным для исследования противосудорожных его свойств, и наоборот.
Помимо этого, такая общая программа исследований делает первичное изучение химических веществ более экономным, информативным, так как позволяет на одних группах животных при минимальных затратах вещества получить максимальную информацию о разных типах активности.
При первичном испытании мы используем только две модели судорожного синдрома: максимальный электрошок (50 мА, 0,2 с, 50 Гц) и коразоловые судороги. Эти два теста, как показывает опыт, достаточны для выявления препаратов, способных подавлять различные типы судорожных синдромов.
Помимо этого, антикоразоловое действие может свидетельствовать о транквилизирующих свойствах вещества, указывать на возможный ГАМКергический механизм активности препарата. Электросудорожный припадок развивается с определенной последовательностью фаз — клонической, тонической, тонико-экстензорной. В процессе оценки действия веществ на данную модель определяются два показателя:
а) количество животных в группе, у которых развилась тонико-экстензорная фаза-
б) количество погибших животных в группе (сравнение контрольной и опытной групп).
Признаком противосудорожного действия вещества являются блокада тонико-экстензорной фазы припадка и защита животных от гибели.
При использовании коразоловой модели судорог коразол вводится внутрибрюшинно в абсолютной смертельной дозе — 150 мг/кг. При этом в контрольной группе у всех животных отмечаются клонические судороги, далее через 3—7 мин. наступает гибель сразу после развития тонико-экстензорной фазы. Оцениваются следующие показатели: а) длительность жизни животных в каждой группе- б) наличие тонико-экстензорной фазы- в) наличие клонической фазы.
Признаками противосудорожного действия веществ является продление жизни в опытной группе по сравнению с контролем, защита от гибели (регистрируется количество погибших и выживших животных в группе), отсутствие тонико-экстензорной фазы, отсутствие или укорочение клонической фазы припадка.
Если противосудорожный эффект выражен ярко и бесспорен (100% защита животных от тонико-экстензорной фазы в тесте максимального электрошока и 100% защита от гибели в тесте с коразолом), можно переходить к этапу углубленного исследования.
Если результат сомнителен, не столь ярок, целесообразно провести уточняющие исследования.
В последнем случае те же тесты повторяются на группах,
включающих большее количество животных, дополняются тестом с внутривенным титрованием коразола, стрихнина и уже после этого выносится решение о проведении углубленных исследований.

Проведение этапа углубленных исследований активных противосудорожных веществ

Этап углубленного исследования имеет целью выявление следующих сторон действия вещества:

1. ) количественное определение противосудорожного  эффекта вещества на разных моделях судорожного синдрома;
2.  сравнение данного вещества по каждому эффекту с таким же показателем эталонного препарата (в качестве эталонных препаратов обычно используются фенобарбитал, дифенилгидантоин, этосуксимид, диазепам);
3.  определение широты терапевтического действия нового вещества, а также защитного индекса и сравнение по этим показателям с эталонным препаратом;
4.  вынесение решения о целесообразности клинических испытаний данного препарата, если он имеет определенные преимущества перед эталонными препаратами;
5.  отнесение к определенной группе антиконвульсантов по механизму противосудорожного эффекта.

В процессе углубленного исследования нами используется довольно широкий набор моделей судорожного синдрома, что дает возможность учесть различные механизмы развития эпилептической активности: 1) тест максимального электрошока (мыши и крысы);

1. коразол в дозе 110 мг/кг- 3) внутривенное титрование 1%-ного коразола, 0,01%-ного стрихнина, бикукуллина, пикротоксина;
2. гиперкинез, вызванный стимуляторами центральных м-холинергических (ареколин), н-холинергических (никотин), серотонинергических (5-окситриптофан) систем мозга- 5) создание очага судорожной готовности путем аппликации 50 ЕД пенициллина через вживленную канюлю на сенсомоторную зону коры мозга крысы- 6) аудиогенные судороги (звонок 100 дБ в течение 1,5 мин) у крыс линии КМ.

В тестах 1, 2, 4, 6 определяются методом Litchfield, Wilcoxon [1949] ЭД-50 — средние эффективные дозы, блокирующие развитие припадка или тонико-экстензорной фазы припадка у 50% животных.
В случае внутривенного титрования коразола, стрихнина, бикукуллина определяются пороговые дозы судорожного яда, вызывающие начало припадка или тонико-экстензорную фазу припадка.
При создании пенициллинового эпилептического очага определяется количество припадков за час, а также специфических изменений ЭЭГ за определенный промежуток времени (минуту) в контроле и через разные промежутки времени после введения испытуемого препарата.
Такой набор тестов позволяет выявить спектр активности нового вещества, уточнить, на каких моделях оно наиболее эффективно.
Количественные показатели, определенные по каждому тесту для эталонного и испытуемого препаратов дают основание для суждения о ценности данного препарата, его преимуществах перед эталонным по выраженности основного эффекта, набору свойств. Далее из этих же показателей определяется широта терапевтического действия (ЛД50/ЭД50), а также защитный индекс (ТД50/ЭД50).
ТД50 — токсическое действие вещества — определяется по способности вызывать токсический побочный эффект, например атаксию, общее угнетение у 50% животных.
Если испытуемый препарат по выраженности основных эффектов, спектру активности, широте терапевтического действия, защитному индексу превосходит известные эталонные препараты, выносится решение о целесообразности изучения его безопасности с целью проведения последующих клинических испытаний.

Дифференцированное изучение групповой принадлежности нового противосудорожного вещества по механизму действия

Описанные выше методические подходы, использование разных моделей судорожного синдрома на целостных животных позволяют хорошо охарактеризовать противоэпилептический эффект, но не дифференцируют разные группы препаратов, обладающих способностью изменять эпилептическую активность.
В этих тестах, по существу, одинаково ведут себя и классические антиконвульсанты типа фенобарбитала, бензонала, и производные 1,4-бензодиазапина и сукцинимиды, и производные вальпроевой кислоты.
В то же время действие этих препаратов на эпилептический процесс неоднозначно.
Исходя из наших данных о возможности разделения препаратов противоэпилептического действия на три группы по их отношению к возникновению и распространению эпилептической активности, предложено на этапе углубленных исследований проводить специальное изучение на идентифицированных нейронах моллюска Helrt pomatia. Электрофизиологические опыты с помощью микроэлектродной техники [Балабан, 1978] проводятся на пейсмекерных «вспышечных» нейронах висцерального ганглия моллюска, на спонтанно активных мотонейронах буккальных ганглиев. Определяется влияние веществ: а) на спонтанную активность нейронов, «вспышечную» активность- б) мембранный потенциал- в) на эффект 0,1- в 0,05%-ного растворов коразола в этих нейронах- г) реакцию на ортодромную стимуляцию.
В качестве количественных показателей, помимо прямой записи активности нейронов на регистрирующем осциллографе, используется: а) частота импульсов в минуту- б) величина трансмембранного потенциала. Испытуемые вещества вводятся в перфузионный раствор в различных концентрациях, чаще 1-10-4М—1-10_6М.

Сопоставление данных этих опытов с результатами экспериментов на моделях судорожного синдрома па животных дает основами отнести новый противоэпилептических препарат к одной из трех групп:

1.  влияющих на эндонейрональную ритмику нейрона, блокирующих возникновение эпилептической активности (типа фенобарбитала) ;
2.  подавляющих и возникновение, и распространение эпилептической активности (типа дифенилгидантоина);
3.  блокирующих только распространение эпилептической активности (типа бензодиазепинов).

В период «сквозных» испытаний с участием специалистов различного профиля изучается действие активного вещества на другие органы и системы, выявляются их дополнительные полезные или нежелательные, побочные эффекты в отношении сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной и других систем организма.
Исследование механизмов действия противоэпилептических препаратов должно опираться на имеющиеся сведения о молекулярно-биологических основах развития эпилептической активности и эффектов антиконвульсантов. Оно включает изучение влияния новых препаратов: 1) на биоэлектрическую активность мозга в норме и при наличии патологического процесса- 2) асимметрию мозга- 3) пространственную синхронизацию деятельности различных областей мозга- 4) активность различных по функциональным характеристикам нейронов, особенно активность пейсмекерных «вспышечных» нейронов- 5) вольт-амперные характеристики ионных токов в мембранах возбудимых клеток- 6) синаптическую передачу- 7) медиаторные системы, особенно взаимоотношения с системой ГАМК- 8) биоэнергетические процессы в нервных клетках- 9) другие системы организма, помимо нервной.