Действие на нервную систему полиметиленовых производных аминопиридина - фармакологическая регуляция психических процессов

ДЕЙСТВИЕ НА ЦЕНТРАЛЬНУЮ И ПЕРИФЕРИЧЕСКУЮ НЕРВНУЮ СИСТЕМУ ПОЛИМЕТИЛЕНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОПИРИДИНА
Именно такого рода активность была выявлена нами в нескольких рядах соединений (группы А-50-56), которые могут рассматриваться как полиметиленовые производные 4-аминопиридина. Это были бициклические и трициклические соединения, одно кольцо у которых повторяло структуру 4-амииоинридина. Примером таких исследованных соединений может быть ряд производных 2,3-цпкло- алкано-4-амцпо-(),7-дп1идро-5Н-1-пириндина общей формулы

Вещества этого ряда синтезированы в Институте азотной промышленности [Упадышева и др., 1977].
Изучение данных и других близких к ним но структуре соединений (амипоакридинов, аминохинолинов) показало их способность стимулировать процесс возбуждения в различных органах и тканях. Причем их эффект превосходит действие 4-амино пиридина по целому ряду параметров [Волкова, Саркисян, 1981- Саркисян, 1981- Шаповалова и др., 1981- Лаврецкая и др., 1982].
Прежде всего было выявлено стимулирующее действие указанных веществ на нервно-мышечную передачу, сократительную активность гладких мышц и центральную нервную систему. Спектр обнаруженной активности давал основания сравнивать их с двумя группами препаратов: 1) ингибиторами холинэстеразы и 2) аминопиридинами. Ингибиторы холинэстеразы в настоящее время, по существу, исчерпывают имеющиеся средства стимуляции нервно-мышечной передачи- аминопиридины в клинике практически не применяются. Проведенное исследование показало, что полиметиленовые производные имеют существенные отличия как от первой, так и от второй группы препаратов. При поиске возможных объяснений обнаруженных отличий было выявлено, что эти вещества обладают по крайней мере двумя механизмами действия на молекулярном уровне — они: а) блокируют калиевую проводимость мембраны и б) ингибируют холинэстеразу. Такое сочетание свойств и приводит к значительному повышению эффективности действия веществ на процесс возбуждения в различных органах и тканях.
Влияние на потенциалозависимые калиевые каналы мембраны
До появления данных о важных эффектах 4-аминопирцдина, богатстве его стимулирующего действия на возбудительный процесс, который приводил к повышению функциональной активности paзличных органов, внимание исследователей мало привлекал такой путь воздействия на возбуждение.
Усилия были преимущественно направлены на активацию натриевых каналов мембраны как основной и самый действенный путь оптимизации процесса возбуждения. Одним из наиболее изученных препаратов, усиливающих натриевые токи в мембране, является алкалоид вератридин (Ulbricht, 1969- Leichl et al., 1977). Вератридин вызывает появление следовой деполяризации в аксоне кальмара и нервных волокнах седалищного нерва лягушки после возникновения потенциалов действия. Высокие концентрации вератридина вызывают деполяризацию мембраны. При этом обнаруживается, что при ступенчатой деполяризации мембраны, помимо обычного кратковременного роста натриевой проницаемости мембраны, появляется еще и медленный вторичный рост натриевой проницаемости. Такая «медленная» натриевая проницаемость не инактивируется, а реполяризация мембраны приводит к медленному ее уменьшению. Для стационарных вольт-амперных характеристик перехватов Ранвье, обработанных вератридином, характерна N-образная форма, которая обусловлена появлением входящего тока в результате деполяризации мембраны. Тетродотоксин устраняет все феномены, связанные с действием вератридина и появлением «медленной натриевой проницаемости».
Вератридин в концентрации 1 10~5 г/мл вызывает заметные изменения в гигантских нейронах моллюска [Leicht et al., 1971]. Во время фазы деполяризации у части клеток появляется «вспышка» потенциалов действия. Изменяются вольт-амперные характеристики нейронов. В нормальном растворе резко увеличивается крутизна вольт-амперной характеристики- мембранный потенциал достигает уровня —20 мВ в связи с резким возрастанием выходящего тока. Для вольт-амперной характеристики нейрона в растворе с вератридином характерен участок с отрицательным наклоном, который исчезает в безнатриевом растворе. Эффект вератридина в нейронах моллюска малообратим. Тетродотоксин здесь не влияет ни на деполяризацию, вызванную вератридином, ни на следовую деполяризацию после серии потенциалов действия, ни на вольт-амперные характеристики. Это объясняется тем, что тетродотоксин не блокирует натриевые каналы соматической мембраны нейрона.
Интересно отметить, что возбуждающее действие вератридина отличается кратковременностью. При действии этого алкалоида более 20—30 мин медленные периодические изменения мембранного потенциала, которые он индуцирует в нейроне, прекращаются. Такое сильное, резкое, но кратковременное стимулирующее действие вряд ли может представить практический интерес для клиники. Подобные вещества могут быть судорожными ядами, но не лекарственными препаратами. В противоположность этому при блокаде калиевых каналов достигается качественно иной тип усиления процесса возбуждения, который отличается большей мягкостью, физиологичностью и постепенным развитием с модуляцией всех звеньев, участвующих в его формировании.
В настоящее время только начинает оцениваться возможность Использования блокаторов калиевых каналов в фармакологии и медицине. Помимо аминопиридинов, пока не описаны никакие другие препараты с подобным спектром активности. Видимо, это в значительной степени связано с тем фактом, что к такого рода веществам еще не привлечено внимание химиков, работающих в области синтеза биологически активных веществ и лекарственных препаратов.
Поэтому особый интерес представляют проведенные нами исследования действия полпметиленовых производных 4-аминопиридина на калиевые каналы мембраны [Шаповалова и др., 1981- Лаврецкая и др., 1982]. Опыты выполнены на перехватах Ранвье седалищного нерва лягушки с использованием метода фиксации напряжения на мембране. Калиевые токи регистрировались при подавлении натриевого тока тетродотоксином.
Вещества А-50-56 (аминоакридины, аминопиридины) сильнее, чем 4-АП, подавляют калиевую проницаемость мембраны (рис. 21). Их эффективные концентрации 1-10-4—1*10-5 М. При этом в концентрации 10-4 М действие на калиевую проницаемость примерно одинаково у двух групп веществ, а в концентрации 1-10-5 М действие препаратов группы А-50-56 превосходит действие 4-АП. В этой концентрации 4-АП подавляет калиевый ток на 50%, а вещество А-56 (2,3-пентаметилен-4-амино-6,7-дигидро-5Н-1-пириндин) — на 70%. Эффект А-50-56 отличается и большей длительностью.
При затягивании тестирующего импульса с 10 мс до 1 с торможение калиевого тока 4-АП полностью исчезает, в то время как блокирующее действие веществ А-50-56 сохраняется. Таким образом, при длительной стимуляции нерва 4-АП как бы «отваливается», в то время как А-50-56 образует более прочный комплекс с мембраной. Целый ряд серьезных отличий наших препаратов от 4-АП дал основания полагать, что полиметиленовые производные действуют на другие популяции калиевых каналов. Они могут воздействовать не только и не столько на быстрые компоненты калиевого тока, но и на Са2+-зависимые и медленные калиевые каналы. Это предположение находит подтверждение в целенаправленных экспериментах на нейронах моллюска и перехватах Ранвье миелинизированиого нервного волокна. Во всяком случае, важным является выявленный нами факт различий в эффектах 4-АП и его полиметиленовых производных как в отношении калиевой проницаемости мембраны, так и в отношении различных функций нервной системы. Способность аминопиридинов, аминоакридинов влиять на иные популяции калиевых каналов находит отражение и в особенностях спектра их фармакологической активности, о которых будет сказано ниже. Это позволяет утверждать, что избирательной блокадой разных компонентов калиевой проницаемости мембраны можно добиваться дифференцированных фармакологических эффектов на уровне целостного организма.
Вещества А-50-56, как и 4-АП, вызывают пролонгирование потенциалов действия мембраны с нескольких мс в норме до 200 мс. Правда, в миелинизированном волокне седалищного нерва лягушки этот эффект веществ обнаруживается не всегда четко. Значительно более постоянным было продление потенциалов действия в мышечных элементах сердца. Это наблюдение о непостоянстве продления
потенциала действия в миелинизированных волокнах находит подтверждение в исследованиях 4-аминопиридина. Так, Thesleff [1980] отметил, что 4-АП пролонгирует ПД в немиелинизированных волокнах В и С- этот эффект мало заметен в миелинизированных А-волокнах, в которых нет времязависимых калиевых токов для реполяризации мембраны. Поэтому в таких волокнах пролонгирование потенциалов действия становится заметным, лишь когда ПД достигает немиелинизированных участков. Препараты А-50-56 были существенно эффективнее 4-АП в продлении ПД мембраны. Здесь они занимают промежуточное место между 4-АП и ТЭА.
Продление потенциала действия тесно связано с блокадой калиевых каналов, вследствие чего затягивается реполяризационная фаза ПД. В связи с этим каждый импульс становится более эффективным. Аминопиридины активно связываются с закрытыми калиевыми каналами, открытие которых прекращает влияние 4-АП на длительность ПД.

Рис. 21. Влияние 4 АП (А) и препарата А-56 (R) на калиевые токи в перехвате Ранвье седалищного нерва лягушки Натриевый ток блокирован тетродотоксином

Вещества группы А-50-56 не вызывают деполяризации мембраны, в то время как 4-АП в некоторых экспериментальных работах индуцировал деполяризацию мембраны, с чем связывают сравнительную кратковременность его блокирующего действия [Магура,1981]. У полиметиленовых производных 4-АП имеется еще одно интересное отличие от аминопиридинов. Первые блокируют не только калиевый, но и натриевый ток в мембране, хотя и в несколько более слабой степени. Это сближает аминопиридины, аминоакридины с фенциклидином, который также является блокатором натриевых и калиевых токов fMarshall, 1982- Pelhate, 1982]. Роль такой блокады натриевой проницаемости мембраны в спектре фармакологической активности препаратов не совсем ясна. Возможно, обнаруженные нами анальгетические свойства этих препаратов частично связаны и с данным эффектом, несмотря на отсутствие блокады потенциалов действия.
Изучение ингибиторов холинэстеразы прозерина и галантамина показало, что они не блокируют калиевые токи в перехвате Ранвье в диапазоне концентраций 1 10~3—10*10~6 М.
Таким образом, новые группы препаратов должны более активно, чем аминопиридины, влиять на импульсзависимый вход Са2+ в пресинаптические окончания, на выброс медиаторов и, следовательно, оказывать наиболее выраженное оптимизирующее действие на проведение возбуждения в различных возбудимых тканях и органах. Это подтверждено целенаправленными исследованиями.

Влияние на холинэстеразу

При изучении действия 4-АП и других аминопиридинов на нервно-мышечную передачу, выброс ацетилхолина внимание исследователей постоянно привлекал факт потенцирования эффектов ацетилхолина. При этом естественно возникал вопрос о возможном влиянии 4-АП на холинэстеразу. Способность усиливать выброс ацетилхолина и ингибировать холинэстеразу рассматривалась альтернативно. Почти все авторы высказываются за первый механизм действия и отрицают способность 4-АП подавлять активность холинэстеразы. Такой вывод обычно базируется на опосредованных наблюдениях, чаще на электрофизиологических исследованиях ПКП и минПКП. Способность 4-АП потенцировать потенциалы концевой пластинки и не влиять на миниатюрные ПКП рассматривается как доказательство его воздействия на выброс ацетилхолина и отсутствия антихолинэстеразной активности или влияния на чувствительность к ацетилхолину постсинаптических рецепторов [Molgo et al., 1977- Thesleff, 1980- Glover, 1982].
Правда, Loffelholz, Weide [1982] на основе анализа тех же показателей (выброса ацетилхолина, минПКП и ПКП) допускают возможность блокады 4-АП холинэстеразы. Тем не менее прямого изучения действия аминопиридинов на очищенные препараты фермента не проводилось.
Нами исследовано действие 4-АП, 2-АП и полиметиленовых производных 4-АП на очищенные препараты ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), полученные из Пермского НИИ вакцин и сывороток. Скорость гидролиза ацетилхолина определяли потенциометрическим методом по начальной скорости изменения pH. Константы ингибирования (К,) и альфа-коэффициент определяли по графикам в двойных обратных величинах [Уэбб, 1966]. Причем альфа-коэффициент характеризовал тип обратимого торможения.
Впервые было обнаружено, что 4-АП и 2-АП являются обратимыми ингибиторами холинэстеразы, однако это действие у них слабо выражено, их константы ингибирования 1,1 -10&ldquo-*—1,5 • 10&ldquo-* М (табл. 38). В то же время новые группы препаратов А-50-56 оказались высокоэффективными ингибиторами холинэстеразы, причем бутирилхолинэстераза подавляется ими еще более активно, чем ацетилхолинэстеразы.
Таким образом, наши вещества существенно отличаются по своему влиянию на активность холинэстераз от известных ингибиторов ХЭ обратимого тина. При этом АХЭ они блокируют смешанным образом (a-коэффициент больше 1, равен 2—2,5)- а БуХЭ они ингибируют по неконкурентному типу (а-коэффицент близок к 1). Прозерин обратимо ингибирует и АХЭ и БуХЭ, но в большей степени ацетилхолинэстеразу, в то время как галантамин является избирательным антихолинэстеразным препаратом и действует преимущественно на ацетилхолинэстеразу, хотя и слабее, чем наши вещества группы А.
Сочетание в спектре действия полиметиленовых производных 4-АП двух свойств — ингибирования холинэстеразы и блокады калиевых каналов мембраны, возможно, не является случайным. Способность ингибировать холинэстеразу отмечена и у дру1их блокаторов калиевых каналов, например у ТЭА. Некоторые антихолинэстеразные препараты оказываются в то же время слабыми блокаторами калиевой проницаемости мембраны. Эти наблюдения позволили Krnjevic [1974] высказать предположение о близости (если не идентичности) белковой структуры холинэстеразы и калиевого канала.
Наши исследования подтверждают возможную связь между этими эффектами веществ. Однако говорить об их идентичности нельзя, так как они неодинаково представлены в спектре действия разных препаратов. 4-АП и ТЭА — сильные блокаторы калиевых каналов и очень слабые ингибиторы холинэстеразы. Физостигмин и другие препараты — активные ингибиторы холинэстеразы и слабо подавляют калиевые токи возбудимой мембраны.
Интересно, что препарат такрин (9-аминотетрагидроакридин) был предложен как ингибитор холинэстеразы для внедрения в клиническую практику [Shaw, Bentley, 1953]. Длительное время он применялся по этому назначению, а также в качестве антагониста морфина. По нашим данным, он является блокатором калиевых каналов. За довольно длительную историю его применения в клинике способность блокировать калиевые каналы мембраны была выявлена у такрина только в последнее время Marshall, 1982- Pelhate. А его анальгетические и кардиотонические свойства долго не могли быть объяснены.
Таблица 38. Влияние веществ на активность холинэстераз мозга II сыворотки крови

Новые группы веществ, описанные здесь, отличаются одинаково сильно выраженными обоими свойствами. Этим и определяется их преимущество перед всеми другими известными препаратами данного профиля действия. Они в одинаковой степени эффективно блокируют калиевые каналы мембраны и подавляют активность холинэстераз. Такое сочетание должно было резко повысить их стимулирующее действие на проведение возбуждения в холинергических синапсах, нервно-мышечных образованиях, гладких мышцах, периферической и центральной нервной системе. Это подтвердилось в последующих экспериментах. Притом было также выявлено, что ингибирование холинэстеразы является сравнительно кратковременным, в то время как все эффекты, связанные с блокадой калиевых каналов, отличались длительностью и прочностью. Видимо, добавление полиметиленовых участков к молекуле 4-АП, дающее соединения типа А-50-56, не уменьшая способности тормозить калиевую проницаемость, на несколько порядков усиливает антихолинэстеразные свойства препаратов. И блокада калиевых каналов приобретает новые черты, связь таких веществ с каналом становится более прочной и длительной.

Влияние на нервно-мышечную передачу

В опытах на нескольких нервно-мышечных препаратах изучено действие полиметиленовых производных 4-АП с использованием стандартных физиологических методик [Andrew, 1975]. В качестве таких нервно-мышечных препаратов применяли диафрагмальный препарат крысы, прямую мышцу живота лягушки, икроножную мышцу кролика. С помощью тензодатчиков, тензоусилителя регистрировали на самописце КСП-4 сократительные ответы мышцы на электростимуляцию нерва или действие ацетилхолина.
При этом было обнаружено, что полиметиленовые производные 4-АП сильно облегчают проведение возбуждения в нервно-мышечном препарате, увеличивают амплитуду мышечных сокращений, а также их длительность (рис. 22). Действие веществ А-50-56 превосходит эффекты 4-АП и антихолинэстеразных средств галантамина и прозерина. Эффект ингибиторов холинэстеразы отличается кратковременностью, он исчезает через 20—25 мин после начала отмывки, в то время как эффект 4-АП и особенно веществ А-50-56 сохраняется и через 1—1,5—2 ч.
Интересно, что 4-АП усиливает сократительные ответы мышцы на электростимуляцию нерва, но почти не влияет на эффект ацетилхолина. Такие же особенности действия 4-АП на нервно-мышечные препараты отмечали и другие исследователи [Bowman et al., 1977]. В то же время наши вещества в одинаковой степени сильно увеличивали сократительный ответ мышцы как на электростимуляцию, так и на действие ацетилхолина. Например, в присутствии вещества А-56 в концентрации 1 -10~6 М сократительный ответ прямой мышцы живота лягушки на введение в омывающий раствор ацетилхолина (1 10_6) превосходил контрольное на 150—180%. Через 30 мин после удаления А-56 из раствора ответ на ацетилхолин все чаще составляет 150% от контрольного- 4-АП в этих опытах слабо усиливает эффект ацетилхолина. Действие галантамина и прозерина несколько слабее по амплитуде сокращений и значительно короче- после их удаления из раствора сократительный ответ мышцы на ацетилхолин почти сразу же падает до контрольного уровня. Такие отличия в действии полиметиленовых производных 4-АП как от 4-АП, так и от наиболее активных антихолинэстеразных препаратов зависит от наличия в их спектре активности пре- и постсинаптического эффектов. Блокада калиевых каналов приводит к увеличенному выбросу медиатора, а ингибирование холинэстеразы — к повышению эффективности воздействия на постсинаптическую мембрану. Наличие только одного из указанных эффектов в спектре действия 4-АП или прозерина и галантамина существенно ослабляет или укорачивает их активирующее влияние на нервно-мышечную передачу.

Антагонизм с миорелаксантами

Рис. 22. Влияние препаратов А-56 (1-10-7 М) (Л), галантамина (1 10-7 М) (Б), прозерина (1 10~7 М) (В), 4-аминопиридина (1 105 М) (Г) на изометрические сокращения при непрямой стимуляции мышцы (френико-диафрагмальный препарат крысы)
Первая (широкая) стрелка указывает подачу веществ в раствор, вторая (тонкая) стрелка указывает начало отмывки
Стимулирующее действие галантамина и прозерина исчезает уже через 20 мин после начала отмывки-
стимулирующее действие А-56 и 4-аминопиридина сохраняется даже через i ч после отмывки

Таблица 39. влияние препаратов на токсичность миорелаксантов

Аминопиридины ослабляют блокирующее действие на нервно-мышечную передачу миорелаксантов недеполяризующего типа. Антикурарное действие у веществ А-50-56 выражено существенно более сильно, чем у 4-АП. Это может быть легко продемонстрировано в двух сериях экспериментов — при изучении токсического действия d-тубокурарина и суксаметония (дитилина) на животных и на изолированные нервно-мышечные препараты. В опытах на мышах 4-АП, 4-50-56 и прозерин существенно ослабляют токсический эффект d-тубокурарина и усиливают действие суксаметония (табл. 39). Все эти препараты уменьшают или полностью снимают блокирующее действие не нервно-мышечную передачу d-тубокурарина. Так, в опытах на прямой мышце живота лягушки d-тубокурарип (1-10-7 М) подавляет реакцию мышцы на ацетилхолин, амплитуда сокращения уменьшается на 25% от исходной величины. Препарат А-56, введенный на 5 мин до миорелаксанта или совместно с ним, восстанавливает н несколько увеличивает сократительный ответ мышцы.
В экспериментах на икроножной мышце кролика d-тубокурарин полностью подавляет сокращения, вызванные электростимуляцией седалищного нерва. После внутривенного введения А-56, 4-АП или прозерина происходит полное восстановление мышечных сокращении.
d-Тубокурарин в дозе 0,25 мг/кг и суксаметоний в дозе 0,12 мг/кг внутривенно вызывают симптом склонения головы у кроликов вследствие блокады нервно-мышечной передачи. А-56 (2 мг/кг), 4-АП (2 мг/кг), прозерин (0,08 мг/кг), галантамин (2,5 мк/кг) снимают эффект d-тубокурарина, но не суксаметония.
В этом случае 4-АП и А-50-56 оказываются слабее прозерина, хотя по длительности антикурарного действия они примерно равны: максимум антикурарного эффекта наступает через 30 мин после введения веществ, а полностью он исчезает через 2,5—3 ч.

Влияние на выброс ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе

Этот эффект веществ исследовали с использованием электрофизиологических методов изучения потенциалов концевой пластинки.
Использовали нервно-мышечный препарат мышей п. peroneus — m. extensor digitorura longus, в котором исследовали ПКП и минПКП.
Описана способность 4-АП в микромолярных концентрациях обратимо увеличивать ПКП- восстанавливать их после частичной блокады перфузией раствором с низким содержанием Са2+ и увеличенным содержанием Mg2`1` [Molgo et al., 1977- Glover, 1982].
В опытах с использованием микроэлектродной техники было обнаружено, что вещества группы А-50-56 увеличивают как квантовый состав, так и амплитуду ПКП, увеличивают долю «гигантских» минПКП. Ингибиторы холинэстеразы прозерин и галантамин влияют только на минПКП, а 4-АП — только на потенциалы концевой пластинки. При этом как 4-АП, так и А-50-56 в концентрации 1-10&ldquo-4—5-10~4 М не только увеличивают амплитуду и длительность ПКП, но и вызывают появление повторных потенциалов. Видимо, это приводит к возникновению спонтанных потенциалов действия в нервных окончаниях. В высоких концентрациях аминопиридины прямо влияют на сократительные свойства мышц и увеличивают их возбудимость.
Таким образом, сочетание пресинаптического и постсинаптического эффектов в спектре действия веществ приводит к увеличению стимулозависимого выброса медиатора, а также, видимо, и к спонтанному высвобождению медиатора.

Влияние на гладкие мышцы

Гладкомышечные объекты представляют особый интерес для изучения спектра активности подобного рода препаратов. Их обычно использовали для выявления рецепторного (холин-, адрен-, серотонинергического) действия веществ. Однако этот объект оказывается полезным и в случае изучения специального действия препаратов на мембрану мышечного волокна, на ионные каналы. Опыты на гладкомышечных органах особенно эффективно позволяют разделить группы блокаторов калиевых каналов и ингибиторов холинэстеразы.
Рядом исследователей показано, что 4-АП, 3-АП, 2-АП приводят к стимулозависимому выбросу медиатора в вегетативных ганглиях, холинергических и адренергических постганглионарных нервных волокнах, что сопровождается повышением сократительной активности гладкомышечных органов [Fastier et al., 1958, 1979- Benoist et al., 1969- Al-Haboubi et al., 1978- Glover, 1982].
Высокие концентрации 4-АП дают тоническое сокращение семявыносящего протока морской свинки и других гладкомышечных органов, которое не снимается альфа-адреноблокаторами или атропином. Такое же влияние в сердце приводит к отрицательному инотропному действию вследствие увеличенного выброса ацетилхолина. А усиление выброса адреналина в адренергических постганглионарных синапсах вызывает в сердце положительный инотропный эффект, продлевает потенциалы действия мышечных элементов сердца IWollmer et al., 1981]. Помимо этого, 4-АП оказывает прямое стимулирующее действие и усиливает сократительную активность мышцы сердца. Причем эти эффекты преобладают над холинергическими влияниями.
Нами исследовано действие 4-АП и полиметиленовых производных 4-АП на гладкие мышцы семявыносящего протока, тонкой кишки и матки крыс. С помощью тензодатчиков, тензоусилителя, согласующего устройства и самописца производили запись сократительных ответов гладкомышечных объектов. В качестве агонистов использовали адреналин, ацетилхолин, окситоцин, гистамин, серотонин, КС1.
При этом было выявлено, что вещества усиливают сократительные ответы всех гладкомышечных органов на действие любого агониста, кроме ионов К+ (табл. 40). Такое же влияние, хотя и несколько более слабое, оказывает 4-АП. Антихолинэстеразные препараты прозерин и галантамин практически пе изменяют ответы гладких мышц на действие агонистов (рис. 23).
Интересно, что в высоких концентрациях (1 10~4 М) вещества А-50-56 вызывают спонтанное сокращение гладкомышечных объектов, особенно матки. Они также увеличивают частоту спонтанных сокращений миометрия крыс, предварительно получавших эстроген.
Вещества не только увеличивают амплитуду сокращений миометрия в ответ на воздействие окситоцином, но и увеличивают длительность этого сокращения в 2 раза. Все эти эффекты в несколько более слабой степени присутствуют у 4-АП, в то время как они не обнаруживаются у ингибиторов холинэстеразы во всем диапазоне концентраций, в которых они выявляют свои эффекты в отношении фермента и нервно-мышечной передачи.
Это дает основания считать, что опыты на гладкомышечных органах существенно лучше, чем эксперименты на нервно-мышечных препаратах, различают данные группы веществ. Исследование действия описанных веществ на нервно-мышечную передачу не так ярко разделяет эффект блокады калиевых каналов и ингибирования холинэстеразы.
Таблица 40. Влияние веществ на сократительные ответы гладкомышечных объектов

Дело в том, что в стимуляции нервно-мышечной передачи принимают участие оба эффекта и различить их не всегда просто, хотя такие подходы существуют. Опыты на гладких мышцах дают однозначный ответ на вопрос о групповой принадлежности изучаемых препаратов — блокаторы калиевых каналов усиливают спонтанную сократительную активность, а также вызванную всеми агонистами, кроме KCL. Ингибиторы холинэстеразы в этих экспериментах мало активны. Действие веществ А-50-56 на гладкие мышцы отличается длительностью, оно сохраняется после отмывки еще в течение 1—2 ч.
Таким образом, эксперименты на гладких мышцах указывают на сильно выраженную способность препаратов типа А-50-56 блокировать калиевые каналы и таким образом стимулировать спонтанную и индуцированную различными агонистами сократительную активность гладких мышц.
Этот вывод подтверждается специальными экспериментами. Замена физиологического раствора Тироде на деполяризующий раствор, содержащий 1250 мМ КС1, полностью снимает потенцирующее действие веществ на эффекты сократительных агентов. Именно такое увеличение амплитуды и длительности сократительного ответа гладких мышц в ответ на воздействие агониста любой природы в условиях нормального электромеханического сопряжения и исчезновение этого эффекта в деполяризационном растворе, когда сохраняется лишь фармако-механическое сопряжение, и следует, видимо, рассматривать как доказательство воздействия на калиевую проницаемость мембраны.
Интересно, что способность 4-АП, 3-АП, 2-АП, 3,4-ДАП вызывать усиление сократительной активности мышц, которая неоднократно описана в литературе, не всегда находила объяснение в их способности индуцировать усиленный выброс медиатора [Benoist et
Р и с. 23. Влияние препарата А-56 на сократительную активность гладких мышц
А — влияние А-56 (5 • 10-6 M) на сократительные ответы миометрия крысы на ацетилхолин (АХ, 1 • 10-6 M), стрелками указано введение в раствор АХ, галантамина (Г) и А-56.
В — влияние А-56 и галантамина на сократительные ответы семявыносящего протока крысы на адреналин (At 1 • 10-* М)

al., 1969- Al-Hoboubi et al., 1978]. Так, 2-АП вызывал тоническую контрактуру кишечника кролика в присутствии атропина- 4-АП давал длительное сокращение семявыносящего протока морской свинки, которое не блокировалось альфа-адреноблокаторами- 4-АП индуцировал осцилляции в мышце пищевода цыпленка, которые не подавлялись ни атропином, ни тетродотоксином. Авторы допускали возможность иного механизма действия веществ на сократительные функции гладкомышечных органов, помимо усиления выброса медиатора.
Наши эксперименты указывают на способность 4-АП и А-50-56 прямо воздействовать на мембрану мышечных элементов и усиливать или вызывать их сократительную активность.
Таким образом, в механизмы их стимулирующего действия может входить не только влияние на высвобождение медиатора в синаптическую щель, но и воздействие на возбудимость собственно мышечных и нервных образований.
Влияние на проведение возбуждения в нерве
Учитывая полученные нами данные о способности аминопиридинов улучшать, усиливать процесс возбуждения в различных возбудимых тканях, целесообразно было также выяснить, могут ли они восстанавливать проведение возбуждения после его блокады.
Рис. 24. Восстановление с помощью А-56 проведения возбуждения в седалищном нерве крысы после блокады 4%-ным КС1
А —потенциалы действия в нерве в ответ на электростимуляцию (отведение биполярное),
Б — блокада ПД с помощью КС1,
В — восстановление с помощью А-56 ПД (через разные промежутки времени после начала обработки нерва).

Опыты выполнены на седалищном нерве лягушек и крыс. Нервный ствол помещали в специальную камеру с фиксированным расположением раздражающих и отводящих серебряных электродов. Участок нерва между ними омывался подогретым (в случае крысы) раствором Рингера. Раздражение подавалось через электростимулятор ЭСЛ-2- использовали стимулы прямоугольной формы длительностью 0,1 мс.
Вызванные потенциалы усредняли (п= 10) статистическим анализатором LP Р4840 фирмы «Nokia». Для блокады проведения возбуждения в нерве использовали раствор КС1 (4%-ный) или новокаин (0,25%-ный). После получения стабильного блока в раствор добавляли испытуемые вещества в концентрациях 1*10-4—1 - 10~в М.
При этом 4-АП (110-4 М) восстанавливал потенциалы действия в нерве на 40—50%, а полиметиленовые производные — на 70—85% (рис. 24). Следует отметить, что аминопиридины и родственные вещества в одинаковой степени хорошо снимают блокаду проведения возбуждения в нерве, вызванную как КС1, так и новокаином.
Подобные исследования аминопиридинов ранее не проводились, однако имеются указания на способность 4-АП снимать блокаду в нервно-мышечном синапсе, вызванную самыми разными агентами — ионами Mg2+, антибиотиками, местными анестетиками, ядами и пр. И этот эффект также связывают с блокадой калиевых каналов, продлением потенциалов действия, усиленным высвобождением медиатора в окончаниях двигательных нервов [Sobek et al., 1968- Burkett et al., 1979- Glover, 1982].
Анальгетическое действие аминопиридинов
Способность аминопиридинов блокировать калиевые каналы, продлевать потенциалы действия возбудимой мембраны и восстанавливать проведение возбуждения в нерве после его блокады дали основания предполагать, что в условиях воспалительных поражений периферических нервов восстановление проведения возбуждения должно сопровождаться и анальгетическим действием. В период воспаления нервов обычно наблюдается набухание миелиновой оболочки, скопление ионов калия под ней [Бадалян и др., 1983]. Блокада калиевых каналов должна приводить к уменьшению этих явлений, а одновременно и к восстановлению проведения возбуждения в нерве и ослаблению болевого синдрома.
Чтобы вычленить такое вторичное анальгетическое действие препаратов, необходимо было выяснить, не обладают ли они исходной анальгетической активностью.
Опыты на мышах и крысах с использованием методов горячей пластинки, внутрибрюшинного введения уксусной кислоты п болевого раздражения хвоста электрическим током [Fastier, Mouat, 1979] показали, что 4-АП обладает слабым анальгетическим действием, у веществ группы А-50-56 оно выражено несколько ярче (табл. 41). Однако все эти препараты уступают по силе и длительности анальгетического действия морфину.

В литературе также имеются указания на анальгетическое действие некоторых аминопиридинов.
Еще в 1956 г. von Haxthausen, анализируя симпатомиметические свойства 4-метил-2-аминопиридина (4М2-АП), предположил возможность у этого вещества анальгетических свойств. И действительно, экспериментальная проверка подтвердила анальгетическую активность 4М2-АП. В опытах на мышах, крысах, кроликах было показано, что 4М2-АП блокирует болевую реакцию, причем сила эффекта достигала 60—70% от анальгетического действия морфина. Анальгетический эффект 4М2-АП блокировался налорфином, а в некоторых опытах и налоксоном [Haxthausen, 1956- Fastier, Mouat, 1979].
В связи с этим было решено проверить, не влияет ли этот препарат на опиатные рецепторы. Опыты были проведены на кишечнике морской свинки- 4М2-АП в концентрации до 1 10_3 М усиливал тоническое напряжение гладкой мускулатуры кишечника п пе подавлял ее сократительную активность. Это действие 4М2-АП не блокировалось налорфином и налоксоном. Такие результаты позволили предположить, что в основе анальгетического действия 4М2-АП лежит центральный эффект, а не взаимодействие с опиатным рецептором. Имеются основания полагать, что механизм действия в данном случае также обусловлен блокадой калиевых каналов в центральной нервной системе и усиленным высвобождением эндорфинов в мозге [Fastier, Mouat, 1979].
Интересно, что анальгетическое действие других аминопиридинов не столь бесспорно, а в ряде экспериментов 4-АП оказался в этом аспекте неэффективным или даже ослаблял действие морфина [Laverty et al., 1979]. Это совпадает с нашими данными: полиметиленовые производные 4-АП проявляют выраженную анальгетическую активность, в то время как 4-АП мало эффективен. Видимо,
Таблица 41. Анальгетическое действие веществ в опытах на крысах

* Разница с контролем статистически достоверна
** ЛД50 4-ЛП 6 мг/кг, галантамина 11 мг/кг, в связи с чем дозы не могли быть повышены.
появление одной метильной группы в структуре 4М2-АП усиливает анальгетическое действие препарата- обезболивающее действие нарастает с увеличением числа метиленовых групп у веществ А-50-56 (см. табл. 41).
Таким образом, подобное усложнение структуры аминопиридинов приводит не только к усилению антихолинэстеразной активности веществ, но и их анальгетического действия.
Есть все основания полагать, что в клинических условиях при целом ряде поражений периферической нервной системы воспалительного характера подобные вещества могут оказывать обезболивающее действие по двум путям: а) реализуя собственные анальгетические свойства- б) уменьшая нарушения транспорта ионов К+, воспалительные изменения в нерве и восстанавливая проведение возбуждения.

Влияние на функции эндокринных органов

Анализ возможных последствий для различных физиологических функций организма блокады калиевой проницаемости мембраны аминопиридинами дает основания ожидать, что это приведет и к стимуляции деятельности некоторых желез внутренней секреции. В свою очередь, повышение функциональной активности ряда эндокринных органов может индуцировать изменения функций центральной нервной системы.
Это предположение подтверждается рядом прямых исследований. Так, тиролиберин и аминопиридины увеличивают высвобождение пролактина из клеток опухоли гипофиза. При этом только тиролиберин увеличивает синтез пролактина [Sand et al., 1980]. Одновременно происходит удлинение Са2+-зависимых потенциалов мембраны. Собственно, это удлинение потенциала действия и приводит к удвоенному количеству пролактина, высвобождаемому из культуры опухоли гипофиза.
С другой стороны, высокие концентрации 4-АП уменьшают базальную секрецию кортикостероидов из срезов коры надпочечников. Они также ослабляют стимулирующее действие кортикотропина и цАМФ на секрецию кортикостероидов. Аминопиридины подавляют потенцирующий эффект высоких концентраций ионов К+ в отношении цАМФ-стимулированной секреции стероидов [Lymangrover, Martin, 1981].
Несмотря на немногочисленность данных, есть основания полагать, что эндокринная система реагирует па действие блокаторов калиевых каналов. Необходимо выяснить суть этих реакций, их длительность и стойкость, что представляет практический интерес. В то же время не исключено, что влияние на гормональные функции зависит от двух эффектов аминопиридинов: а) прямого влияния на мембрану клеток эндокринных желез, а следовательно, на синтез и высвобождение гормона- б) опосредованного воздействия путем стимулирующего влияния на регулирующие нервные центры.

Влияние на центральную нервную систему

Изучено действие аминопиридинов и их полиметиленовых производных на функции центральной нервной системы. Как уже подчеркивалось, описано стимулирующее и судорожное действие 4-аминопиридипа, его антагонизм со снотворными и седативными средствами Shaw, Bentley, 1953- Agoston et al., 1978- Haas et al. Более подробно центральные эффекты аминопиридинов не исследовались.
С помощью набора тестов, описанного выше, нами изучено действие аминопиридинов на различные функции центральной нервной системы.
Показано, что изученные препараты в малых дозах слабо влияют на поведение животных. В средних дозах появляется стимулирующее действие: повышается спонтанная активность экспериментальных животных, их реакции па раздражители. При дальнейшем повышении доз возбуждающее действие усиливается, отмечаются судорожные подергивания, признаки стимуляции м-холинергических систем, в том числе слюнотечение, усиленное потоотделение, диарея, тремор. В токсических дозах гибель животных наступает при выраженном возбуждении и судорогах.
Интересно, что у 4-АП отмечается достаточно высокая токсичность, его ЛД50 составляет 6 мг/кг, а холиномиметические действие появляется только в терминальных фазах. Вещества А-50-56 существенно менее токсичны, их смертельные дозы варьируют от 45 до 60 мк/кг, а холиномиметические эффекты появляются в дозах 18—25 мк/кг.
Стимулирующее действие аминопиридинов обнаруживается через 5—10 мин после введения и продолжается около 45 мин. При длительном введении крысам в тех же дозах (10—20 мг/кг) отмечаются периоды возбуждения, саливация, тремор. У собак также только при длительном введении они вызывают стимулирующий эффект — повышенную подвижность, беспокойство.
Аппликация 4-АП и А-56 на сенсомоторную область крысы в течение 2—3 мин приводит к развитию возбуждения и судорог.
Вещества в дозах 2—10—20 мг/кг несколько ослабляют действие снотворных (табл. 42).
В тестах взаимодействия аминопиридины усиливали действие стимуляторов медиаторных систем мозга — ареколина, никотина, фенамина, апоморфина, Л-ДОФА. При этом они в большей степени потенцируют эффекты ареколина. Даже в небольших дозах они резко усиливают гиперкинез, вызванный ареколином, повышают слюнотечение, гипергидроз, диарею. Высокие дозы этих веществ вызывают гибель животных после введения им ареколина. Значительно слабее действуют препараты на эффекты фенамина, апоморфина, Л-ДОФА, никотина, 5-окситриптофана, хотя и в данных тестах обнаруживается определенное потенцирующее влияние аминопиридинов (табл. 43т 44).

Таблица 42. Влияние препаратов на эффект снотворных

* Разница с контролем статистически достоверна.

Таблица 43. Влияние веществ на эффекты фенамина, апоморфина, Л-ДОФА

* Разница с контролем статистически достоверна.
Необходимо отметить, что 4-АП и 2-АП оказывают не столь выраженное потенцирующее действие на эффекты ареколина- они умеренно усиливают центральные эффекты всех перечисленных медиаторных агентов.

Как видно из таблицы, имеется определенное различие в действии представителей трех групп препаратов — 4-АП, А-56 и прозерина. 4-АП почти в равной степени усиливает действие всех стимуляторов медиаторных систем- А-56 потенцирует эффекты всех стимуляторов, но в наибольшей степени м-холиномиметика ареколина- прозерин потенцирует эффект только ареколина. Это становится понятным, исходя из представленных данных о способности аминопиридинов усиливать выброс медиаторов во всех синапсах. Наличие комбинированных свойств у препаратов группы А-50-56, их способность блокировать одновременно ионные каналы в мембране и холинэстеразу обеспечивают преимущественное влияние на м-холинергические системы мозга и более слабое — на другие медиаторные системы. Прозерин — классический ингибитор холинэстеразы, не проявляющий выраженной активности в отношении калиевых каналов мембраны, стимулирует в основном м-холинергические системы мозга. И наоборот, 4-АП, в спектре действия которого эффект в отношении холинэстеразы представлен слабо, оказывает почти одинаковое стимулирующее влияние на все медиаторные системы мозга.
Таким образом, проведенный фармакологический анализ подтверждает особое влияние блокаторов калиевых каналов на выброс медиаторов и в центральной нервной системе. Все же следует подчеркнуть, что этот эффект представлен умеренно, в связи с чем они не вызывают выраженного возбуждения, усиления двигательной активности и других поведенческих реакций. Помимо этого, не исключено, что способность увеличивать выброс медиаторов как в возбудительных, так и в тормозных синапсах в итоге приводит к небольшому общестимулирующему влиянию на центральную нервную систему. Специальный фармакологический анализ указывает также на тот факт, что аминопиридины в большей степени стимулируют адренергические и норадренергические системы в периферической и центральной нервной системе.

Таблица 44. Влияние вещества на эффекты ареколина, никотина. 5-окситриптофана.

* Разница с контролем статистически достоверна.

В опытах на гладких мышцах они наиболее активно потенцируют действие адреналина на семявыносящий проток. Их влияние на эффекты фенамина в ЦНС более выражено, чем воздействие на эффекты дофаминостимуляторов апоморфина и Л-ДОФА, а также предшественника серотонина — 5-окситриптофана и триптамина (см. табл. 44). Эти выводы согласуются и с наблюдениями ряда авторов, изучавших сердечно-сосудистые эффекты 4-АП и показавших преобладание норадренергических влияний препарата над холинергическими [Sobek et al., 1968- Yanagisawa, Taira, 1979- Glover, 1982]. Остается неясным, почему именно система адреналина и норадреналина стимулируется аминопиридинами особенно активно.
Однако эта закономерность сохраняется и для полиметиленовых производных 4-аминопиридина. В опытах на целостных животпых ярко проявляется их способность ингибировать холинэстеразу и оказывать м-холиномиметическое действие в центральной нервной системе и на периферические органы. В опытах на изолированных гладкомышечных органах, когда ингибирование холинэстеразы не проявляется, преобладает адреномиметическое действие препаратов- они в большей степени потенцируют эффекты адреналина, чем ацетилхолина, гистамина и других агонистов (см. табл. 40).
Влияние аминопиридинов на биоэлектрическую активность мозга
В опытах на крысах с вживленными электродами в сенсомоторную область коры, гиппокамп, ретикулярную формацию и гипоталамус было выявлено стимулирующее действие 4-АП, 2-АП и полиметиленовых производных А-50-56 на биоэлектрическую активность мозга.
В малых дозах (1—2 мг/кг) препарат А-56 вызывал ускорение ритма ЭЭГ в гипоталамусе, коре и гиппокампе. При этом уменьшалась амплитуда доминирующего ритма. Изменения биоэлектрической активности прежде всего регистрировались в гипоталамусе и коре мозга. С увеличением дозы до 5—10 мг/кг (10—20% от ЛД50) десинхронизирующее действие обнаруживалось во всех областях мозга.
Такое же действие на электрофизиологические характеристики мозга оказывали 4-АП и 2-АП, но в существенно большей дозе — 2—4 мг/кг, что составляет 30—40% от ЛД50.
Изучено действие полиметиленового производного 4-АП на вызванные потенциалы (ВП) в слуховой коре мозга кролика в ответ на бинауральный слуховой стимул (щелчок). Регистрировали BIT с латентным периодом 18—20 мс и суммарной амплитудой 200— 400 мкВ. Определяли также коэффициент функциональной асимметрии мозга (ФМАс), который характеризует межцентральные взаимоотношения. Степень выраженности ФМАс достаточно стабильна, но индивидуальна для каждого животного.
Полиметиленовое производное (А-56 в дозе 2—5 мг/кг) вызывает существенное увеличение амплитуды ВП и коэффициента ФМАс. Это свидетельствует о способности препаратов данной группы улучшать функционирование мозга в целом и слуховой сенсорной системы в частности [Вианки, Удалова, 1975- Gl