Методика исследования полового хроматина - гипоспадия и ее лечение
Видео: Искривление полового члена лечение
Материалом для первых исследований полового хроматина, выполненных Барром с сотрудниками, служили нервные волокна самцов и самок кошек. Было выявлено, что при окраске по Фельгену (реакция на нуклеиновые кислоты) хроматиновая субстанция в клетках самцов рассредоточена в виде мелких зерен равномерно по всему ядру.
В ядрах клеток самок, кроме диффузно распределенного хроматина, имеется еще эксцентрически расположенная глыбка размером 1,5—2 микрона, лежащая под оболочкой ядра, более интенсивно прокрашивающаяся по Фельгену и имеющая чечевицеобразную или треугольную форму. При подсчете этих глыбок оказалось, что в ядрах клеток женского организма они содержатся в 70— 90%, а в ядрах клеток мужского организма — в 5—10% с ошибкой ±5%. Барр с сотрудниками назвали эту глыбку хроматина половым хроматином, Аспергер — «краевым хроматином», или «ядерным сателлитом», Закс, Серр и Данок (Sachs, Serr, Danok) — половым хромоцентром (рис. 4, а, б).
В дальнейшем оказалось, что половые особенности в расположении хроматина присущи ядрам всех клеток организма— клеткам слизистой рта (Мур с сотрудниками), кожи (Тетер, Барр, Закс с сотрудниками) и других тканей. В 1954 г. половой хроматин обнаружен в ядрах сегментарных лейкоцитов, хотя подсчет их менее убедителен, чем в других клетках. По данным Дэвидсона, Дукса, Добровского (Davidson, Dux, Dabrowska), при изучении 500 сегментоядерных лейкоцитов у женщин половой хроматин в виде «барабанных палочек» обнаруживается в 5—б лейкоцитах, в то время как у мужчин он в лейкоцитах не встречается. Скопления хроматина напоминают «барабанные палочки» на очень тонкой ножке.
В настоящее время наиболее распространено исследование полового хроматина в ядрах клеток кожи, слизистых оболочек и сегментоядерных лейкоцитов, хотя последний метод и содержит элементы субъективности ввиду того, что, кроме истинных «барабанных палочек», встречаются ложные, которые нелегко отличить от истинных.
Рис. 4. Расположение хроматина в ядрах эпителиальных клеток мальпигиевого слоя кожи (окраска по Фельгену). Микрофотография.
ок. 90, об. 15:
а — у женщин- ядерные сателлиты, половой хроматин в виде эксцентрически расположенных зерен- П - у мужчин. распределение хроматина в виде мелких
зерен.
Исследование кожи. Для исследования берется кусочек кожи до подкожножировой клетчатки размером 0,5X1 см. Решающим условием для получения хороших препаратов является правильная и быстрая фиксация.
Кусочек кожи лучше привязать к стеклянной палочке (для предотвращения деформации) и немедленно опустить в фиксирующую жидкость. При окраске по Фельгену лучшим фиксирующим раствором считается смесь Дэвидсона (спирт 96°—35%, ледяная уксусная кислота—10%, формалин — 40°—20%, Aquae Dest — 35%).
Окраска крезил-виолетом и гематоксилин-эозином допускает фиксацию в буферном нейтральном 10%-ном растворе формалина (Арно и др.). Минимальный срок фиксации 24 часа. Затем материал или обрабатывается или переносится в спирт, где без ущерба может храниться неограниченное время. Толщина срезов должна быть не больше 5—7 миллимикрон- при толщине 12—15 миллимикрон, как это рекомендуют Бро-Расмуссен, Хансен и Мур, изучение тонкой структуры ядра весьма затруднительно.
Нецелесообразно прибегать к яркому освещению при изучении препаратов. Диафрагмированием и регулированием высоты конденсатора можно добиться максимально лучшего выявления тонкой структуры ядер, в то время как яркое освещение скрадывает разницу в интенсивности окраски различных элементов ядра. Лучшее выявление полового хроматина дает окраска по Фельгену, хотя она и сложнее. В отличие от окраски гематоксилин-эозином или крезил-виолетом окраска по Фельгену сводит до минимума возможность ошибок. Она требует скрупулезного соблюдения условий, чистых и свежих реактивов.
Гарнден, Армстронг, Барр, Грене описали несколько случаев гинандроморфизма по половому хроматину у больных гермафродитизмом, который характерен тем, что с одной стороны тела половой хроматин располагается по мужскому типу, с другой — по женскому. Поэтому для исключения возможной ошибки в случаях, где у больного гипоспадией имеются черты гермафродитизма, рекомендуется брать материал (кожа, соскоб слизистой) с обеих половин тела.
Препараты изучаются под иммерсией- учет полового хроматина производится на 100 сосчитанных клеток базального слоя. Более поверхностные слои для изучения непригодны.
Исследование эпителия слизистой рта, которое предложил Мур с сотрудниками, — это попытка избежать хирургической биопсии, заменить ее простым методом взятия материала и тем самым расширить возможность клинического использования метода.
Нами этот метод использован таким образом: соскоб слизистой берется с внутренней поверхности щек или, если нет необходимости симметричного исследования, со слизистой нижней губы у места, где заканчивается уздечка. Последнее предпочтительнее ввиду хорошего доступа. Ротовая полость предварительно тщательно прополаскивается 2%-ным содовым раствором, что несколько уменьшает примесь слизи и микробов к исследуемому материалу.
Эпителий слизистой полости рта снимается стеклом с несколько закругленными углами с намеченного места слизистой, выпяченной при надавливании пальцем снаружи. Так как для исследования пригоден только базальный слой, соскоб должен производиться при энергичном давлении. Слизистый материал, имеющий вид взвеси с мелкими включениями, для исследования непригоден, так как содержит только клетки отторгающегося верхнего слоя- необходимо получить отдельные тонкие пленки слизистой оболочки, что иногда сопровождается легким кровотечением.
Как и при взятии кожи, соскоб слизистой после равномерного распределения по стеклу немедленно фиксируется. Диксон и Тарр, Нокес и Фиш (Dixon а. Тагг, Noques a. Fisch) рекомендуют фиксировать материал в течение 24 часов в смеси равных частей спирта и эфира. Препараты окрашиваются крезил- виолетом или по методу Папаниколау и при необходимости длительного хранения обычным методом заключаются в канадский бальзам.
Лучшие результаты при обработке соскоба слизистой мы получили при фиксации материала в течение 24 часов в смеси Дэвидсона с последующей окраской по Фельгену (как и при взятии кожи). Клетки базального слоя, подлежащие изучению, прокрашиваются в светло-малиновый цвет, клетки отживающих слоев, не пригодных для изучения, — в светло-коричневый.
Исследование полиморфноядерных лейкоцитов предложено в 1954 г. Дэвидсоном. Для изучения полового хроматина в сегментоядерных лейкоцитах пригодны препараты крови, приготовленные обычным способом для подсчета лейкоцитарной формулы. Удовлетворительные результаты можно получить при окраске по May-Grunwald-Giems&rsquo-y. Препараты должны быть тонкими и равномерно окрашенными, так как в толстом слое при фиксации лейкоциты сморщиваются и становятся не пригодными для изучения хроматина. Для подсчета лейкоцитов, содержащих половой хроматин, при помощи препаратоводителя под иммерсионной системой просматривается до 500 лейкоцитов. Изучение такого количества клеток дело трудоемкое и занимает не менее 1,5 часов. Кроме того, в оценке находок полового хроматина возможен значительный элемент субъективизма, так как отличить истинные «барабанные палочки» хроматина от ложных не всегда легко (рис. 5, а, б, в).
Рис. 5. Расположение полового хроматина в ядрах полиморфноядерных лейкоцитов:
а — истинные «барабанные палочки», половой хроматин у женщин- б — ложные «барабанные палочки» на толстой ножке, встречаются как у женщин, так и у мужчин- в — ложные «барабанные палочки», часто множественные, встречаются только у мужчин.
Наш опыт исследования полового хроматина позволяет заключить, что предпочтение должно быть отдано гистологическому исследованию кожи как наиболее точному и чистому методу, хотя и связанному с небольшим хирургическим вмешательством. При тщательном соблюдении техники окраски этим методом можно получить отчетливые и убедительные результаты. Исследование соскоба слизистой рта отличается простотой взятия материала, что делает этот метод доступным даже при амбулаторном исследовании больных. Однако примесь к материалу значительного количества слизи затрудняет изготовление качественных препаратов, а присутствие микробов — их изучение. Последнее обстоятельство может быть причиной ошибок в оценке различных ядерных включений, поэтому метод исследования соскобов слизистых рекомендуется в качестве ориентировочного метода при исследовании в амбулаторных условиях детей. Метод исследования полового хроматина в полиморфноядерных лейкоцитах чрезвычайно прост и легко выполним в условиях каждой лаборатории (чего нельзя сказать о методе Фельгена), однако изучение препаратов представляет очень трудоемкий процесс. В соединении же со значительным элементом субъективизма этот метод вряд ли станет распространенным методом в обычных лабораториях.
Изучение полового хроматина у наших больных показало, что расположение, характерное для генетического мужского пола, выявлено у 46 больных гипоспадией без признаков гермафродитизма. У 6 больных с явлениями истинного гермафродитизма половой хроматин также располагается по мужскому типу. Все трое больных ложным женским гермафродитизмом оказались носителями женского хроматина (что соответствует данным Аспергера, Вилкинса и др.).
Полученные нами данные в основном совпадают с данными зарубежной литературы и свидетельствуют о том, что определение генетического пола является существенным, особенно при определении пола у новорожденных (в затруднительных случаях) и у взрослых больных гипоспадией, у которых при рождении пол был записан неправильно. Случаи, где изучение полового хроматина способствовало коррекции пола, описали Воевский, Бенуа (Benoit) и др.
Однако самое большое значение половой хроматин имеет при дифференциальной диагностике тяжелых форм гипоспадии и ложного женского гермафродитизма у новорожденных и детей раннего возраста. В этих случаях социальный пол и психоориентация еще не играют роли при уточнении пола и генетический пол может оказаться решающим. Кроме того, привлечение в сомнительных случаях еще одного фактора детерминации пола будет способствовать уменьшению ошибок при определении пола и устранению их там, где они уже допущены.
