Существует ли «контактное торможение»? - рак: эксперименты и гипотезы
Факторы роста против него
До сих пор мы допускали, что контактное торможение возникает как следствие контакта между клетками: клетки растут до тех пор, пока контакты со всех сторон не начинают сдерживать их дальнейший рост.
Как полагают, в организме деление клеток находится под контролем благодаря наличию ингибиторов, вырабатываемых тканью (мы называли их «халонами»). Если перенести это представление на культуры клеток, это будет означать, что следует искать ингибиторы, вырабатываемые покоящимися клетками и способные специфически блокировать деление клеток.
До настоящего момента поиски, по-видимому, не приносили успеха. Клетки можно культивировать на мембранных фильтрах. Если верхняя поверхность диска фильтра полностью обрастает клетками, то для новых клеток остается возможность расти на нижней поверхности. Следовательно, клетки, разрастающиеся по верхней поверхности фильтра, не вырабатывают ингибиторов.
Судя по всему, регуляторный механизм интактной ткани не играет роли в регулировании деления клеток в культуре. Однако это не значит, что контактное торможение происходит главным образом при контакте клеток. Холли нашел простое решение этой проблемы, изучая рост клеток ЗТЗ (постоянный штамм фибробластов мыши).
Клетки ЗТЗ демонстрируют особо яркий случай контактного торможения. В нормальных условиях культивирования они вырастают до сплошного монослоя, а по достижении этой стадии тотчас прекращают рост. При этом плотность клеток достигает 106 на одну чашку Петри (диаметром 6 см).
Однако исследователи давно подметили — и не только для клеток ЗТЗ,— что при добавлении среды, содержащей свежую сыворотку теленка, в культуре клеток с остановившимся было ростом отмечается новая волна митозов. Это обстоятельство заставляет предположить, что факторы роста в сыворотке теленка преобладают над контактным торможением.
Видео: Новости науки от 13.10.2016 (лечебный котофей)
Фиг. 27.
Затем Холли обнаружил, что плотность клеток в культуре с контактным торможением зависит от концентрации питательных веществ в среде. Клетки ЗТЗ растут до различной конечной концентрации в зависимости от содержания сыворотки в среде (фиг. 27).
Но при посадке 6 -106 клеток на чашку Петри культура завершает свой рост независимо от концентрации сыворотки. Это не нашло своего отражения на кривых роста. Следовательно, за окончательную концентрацию клеток в культуре клеток ЗТЗ, очевидно, ответственны один или несколько факторов роста, содержащихся в сыворотке теленка. По мере исчерпывания этих факторов рост прекращается.
В результате оказывается, что клетки ЗТЗ не растут в «истощенной» среде (см. рис. 27): если взять среду стационарной культуры и добавить ее к другим клеткам ЗТЗ, деления клеток не произойдет. Новые деления возможны лишь при добавлении свежей сыворотки теленка.
Опухолевые клетки ведут себя совершенно иначе: клетки ЗТЗ, трансформированные вирусом SV-40, растут даже в «истощенной» среде. Это значит, что их потребности в факторе роста значительно ниже. Сходные наблюдения были сделаны на культуре фибробластов цыпленка (Темин): нормальные фибробласты испытывали потребность в свежей сыворотке, между тем как фибробласты, трансформированные вирусом саркомы Рауса, обходились гораздо меньшими ее количествами.
Следовательно, важнейшее различие между нормальной и опухолевой клетками в культурах тканей заключается в разных потребностях в факторе роста. Имеют ли при этом место контакты, не столь существенно.
Но, пожалуй, еще рано заменять в наших мысленных построениях «контактное торможение» «факторами роста». Даже рассматриваемые совместно с мембранным контролем факторы роста, по-видимому, не дают полного представления о том, что происходит на самом деле.
Ингибиторы гарантируют контактное торможение
Вернемся вновь ненадолго к клеткам ЗТЗ, на которых особенно наглядно можно продемонстрировать контактное торможение. Что произойдет, если выращивать эти клетки в культуре с постоянно обновляемой средой (так называемая перфузионная культура)?
Если лишь факторы роста определяют максимально достижимую плотность клеток, то клетки ЗТЗ, выращиваемые в подобных условиях, должны нарастать друг на друге, образуя в итоге многослойные культуры. Именно этого и не происходит. Кастор провел киносъемку перфузионной культуры ЗТЗ и обнаружил, что эти клетки все равно растут в виде монослоев. Прибегнув к цейтрафферной (замедленной) съемке, Кастор заметил то, что Холли удалось увидеть до него, а именно что эти клетки сжимаются после первичного контакта, но все же останавливают свой рост. Следовательно, даже в таких условиях конечное число клеток в культуре ограниченно.
Что же тогда ограничивает рост клетки, если клеточные контакты и факторы роста не определяют всей картины? Не исключено, что контакт между клетками в достаточно плотном слое обусловливает производство ингибитора, который и останавливает деление клеток. Йе и Фишер поставили эксперимент, подкрепляющий представление других ученых о том, что такие факторы действительно существуют в «старой» среде (то есть среде от культуры с контактным торможением). Обновляя среду в культуре с остановившимся ростом, можно вызвать дополнительные митозы примерно у 6% клеток. Как ни странно, удалось также инициировать подобные «запрещенные» клеточные деления еще одним способом: «старую» среду сначала заменяли физиологическим раствором, а раствор в свою очередь вновь замещали старой средой.
Этот на первый взгляд удивительный факт можно объяснить, если предположить наличие ингибитора: физиологический раствор отмывает ингибитор и клетки вновь оказываются готовыми к делению. Первые этапы синтеза новой ДНК и последующие митозы начинаются уже в физиологическом растворе (на основании данных по синтезу РНК, согласно Йе и Фишеру), но этот процесс не находит своего завершения в физиологическом растворе из-за недостатка питательных веществ. Последние поставляются «старой» средой, которая и заменяет физиологический раствор. Конечно, ингибитор все еще присутствует в старой среде, но, поскольку процесс, ведущий к делению, уже начался, он не влияет на начавшийся митоз. (Ингибитор имеет низкий молекулярный вес и отмывается путем диализа старой среды.)
Приведенные данные противоречат результатам описанного выше эксперимента с миллипоровым фильтром, где было показано, что клетки, образующие монослой на верхней поверхности фильтра, не выделяют ингибиторов роста. Однако это противоречие легко устранимо: ингибитор Йе и Фишера вовсе не должен подавлять растущие клетки. Его предназначение—поддерживать контактное торможение. Поэтому не следует удивляться, что он не ингибирует клетки, не находящиеся в контакте. (Правда, некоторые клетки, такие, как фибробласты WI -38 человека, изученные Гарсией-Жираттом, по-видимому, все же продуцируют вещества, подавляющие и растущие клетки.)
Анализ рассмотренных исследований непосредственно подводит нас к концепции халонов, о которой мы говорили на стр. 103. Халоны также являются ингибиторами, которые воздействуют на клетки, находящиеся в контакте в ткани (опуская сомнительные халоны лейкоза). Как отмечалось выше, концентрация халонов зависит от массы ткани. В клеточных культурах, очевидно, действуют сходные механизмы: по достижении определенной предельной плотности клеток концентрация ингибитора оказывается достаточной, чтобы остановить деление клеток во всей популяции.
Таким образом, регуляция роста в культуре ткани, какой бы искусственной она ни казалась на первый взгляд, обнаруживает очевидное сходство с регуляцией роста в интактном органе. Но этого следовало ожидать, так как поведение клеток в культуре ткани позволяет судить об их поведении и в организме животного: опухолевые клетки, которые не следуют предписанному порядку in vivo, не подчиняются и правилам «контактного торможения» в культуре клеток.
Рассмотрим еще раз факторы, определяющие максимальную плотность популяции в культуре ткани, даже если нарисованная нами картина и оказывается неполной:
а) наличие факторов роста самих по себе не вызывает сомнений-
б) одних ингибиторов недостаточно-
в) более того, очевидно, недостаточно и самих клеточных контактов.
И все же ясно, что такие контакты, равно как и клеточные мембраны, играют важную роль в решении вопроса о том, будут ли клетки взаимно подавлять друг друга. Безусловно, существует нечто более важное, чем различия в свойствах поверхностей мембран опухолевых и нормальных клеток, более существенное, чем простые различия, о которых мы здесь говорили (связывание кальция, содержание нейраминовой кислоты и т. д.). Недавно удалось обнаружить различия между мембранами опухолевой и нормальной клетки, которые, возможно, имеют непосредственное отношение к фактору роста. Иными словами, была установлена причина, в силу которой опухолевые клетки растут без контактного торможения, в то время как нормальные клетки подчиняются «порядку».
