Трансформация in vitro - рак: эксперименты и гипотезы
Как правило, опухолевые вирусы могут не только «проедать» дырки в слое соответствующих клеток, но и нарушить строгий порядок в культуре ткани.
Многие клетки, выращиваемые в культуре ткани, подчиняются общему порядку: они делятся только до тех пор, пока есть место. Если образуется толстый слой клеток, деления прекращаются: тесные контакты между клетками предотвращают новые митозы (феномен «контактного торможения»).
Клетки, инфицированные опухолевыми вирусами, иногда отказываются подчиняться этим правилам: они продолжают расти, даже «наползая» на соседей и образуя неравномерные слои. Такие морфологические признаки уже сами по себе в какой-то степени напоминают небольшие опухоли. Более того, по существу доказано, что нагромождающиеся друг на друга клетки суть не что иное, как настоящие опухолевые клетки. Если их имплантировать подходящему реципиенту (животному того же инбредного штамма, от которого первоначально были взяты клетки для данной культуры), то у животного образуются настоящие опухоли.
Другими словами, «беспорядочно растущие клетки» под влиянием опухолевого вируса превращаются в опухолевые клетки (фиг. 40).
Признаки трансформированной клетки
- Усиленный темп роста.
- Возможность неограниченного пассирования в культуре ткани («постоянная линия»).
- Утрата контактного торможения («нагромождения клеток» и «беспорядочный рост»).
- Образование вирусспецифических антигенов.
- Образование опухолей с иммунологической совместимостью.
Трансформация и гибель клетки
Трансформация и гибель клеток могут сопровождать друг друга: если клетки эмбриона мыши инфицировать вирусом полиомы, то, помимо просветлений в клеточном слое, можно наблюдать и характерные беспорядочные нагромождения клеток.
Но гибель клеток и трансформация — процессы столь различные, что напрашивается предположение о наличии двух различных типов вирусов. В таком случае вирусы, выделенные из участков отдельных просветлений, казалось бы, должны были вызывать только просветления, но не трансформацию.
Однако опыт показал обратное: трансформация и разрушение клеток сопровождали друг друга даже в тех случаях, когда вирионы были выделены из одного просветления. Следовательно, один и тот же вирус может вызывать как продуктивную инфекцию, так и трансформацию.
Клетки могут делать выбор между продуцированием вируса и трансформацией
Решение о том, примет ли клетка участие в продуцировании вирусов с последующим своим распадом или подвергнется трансформации и станет опухолевой, в значительной мере зависит от клетки-мишени. Известны линии клеток, которые преимущественно лизируются вирусом SV- 40, и такие, которые преимущественно подвергаются трансформации (см. фиг. 40).
Играют роль не только наследственные свойства клетки, но и ее физиологическое состояние. Вирусной трансформации гораздо легче подвергаются растущие, делящиеся клетки,чем клетки покоящиеся (так называемые стационарные клетки). Вирусная ДНК, вероятно, легче встраивается в ДНК клетки в процессе ее репликации. Это означает, что важна не только линия клеток, но и фаза клеточного цикла.
Разумеется, клетки не вполне свободны в «принятии решения»: если обработать клетки избыточным количеством SV-40, который обычно вызывает лишь трансформацию (множественная инфекция), то может произойти «запрещенное» продуцирование вируса.
В одной клетке может быть произведено несколько тысяч вирусных частиц, а трансформированные клетки, наоборот, как бы вовсе не содержат вируса.
«Маскированные» вирусы
Собственно говоря, в том, что трансформированные клетки больше не содержат вируса, нет ничего удивительного. Этот факт согласуется с прежними данными о том, что в опухолях, индуцированных вирусами, вирус часто не удается наблюдать. (Так, быстро растущая папиллома Шоупа у домашних кроликов более не содержит вируса Шоупа.)
Здесь возможны два объяснения:
- Вирусы действительно вызывают трансформацию, но сформировавшейся опухолевой клетке они больше не нужны. Следовательно, вирусы могут не только прятаться, но и в самом деле исчезать.
- Но, как выяснилось, хотя вирусы и могут, повидимому, прятаться, они все же не теряются: они внедряются в клетку и живут в ней в «замаскированной» форме.
Классической моделью таких «маскированных» вирусов являются бактериофаги. Фаги — это вирусы, которые размножаются в бактериях и лизируют клетки бактерий. Однако размножение и лизис наступают не всегда. Иногда наблюдается так называемая «безмолвная инфекция» 1 , при которой фаг проникает в клетку, но не разрушает ее. Потомство таких инфицированных бактериальных клеток кажется здоровым, однако они могут внезапно начать бурное продуцирование фаговых частиц и разрушаются.
*В отечественной медицинской литературе принят термин «дремлющая инфекция». — Прим. ред.
Различные факторы определяют такой отсроченный взрыв: ультрафиолетовое облучение, рентгеновское облучение, перекиси, различные красители и канцерогены.
В латентно-инфицированных бактериальных клетках вирус не выявляется, однако после лизиса он внезапно вновь появляется в изобилии. В таких клетках он как бы впадал в спячку, но тем не менее принимал участие во всех клеточных делениях и, таким образом, вел себя подобно гену.
«Союз» бактерии и фага можно уподобить «браку», который в один прекрасный момент распадается под влиянием внешних воздействий: вирусный геном «принимает управление» и начинает заниматься исключительно размножением фага. Хозяин поставляет все сборочные конвейерные линии и энергию на службу фагу и в конце концов гибнет.
ДНК опухолевых вирусов отдаленно напоминает такие латентные фаги. Вирус полиомы и SV-40 также не исчезают полностью из трансформированных клеток. Даже в по всей видимости свободных от вируса опухолевых клетках имеются «свежие следы», свидетельствующие о присутствии вируса.
По следам «маскированных» вирусов: вирусснецифические антигены
Первые следы удалось обнаружить благодаря иммунологическим методам: в клетках, трансформированных вирусом, содержатся антигены, отсутствующие в нормальных клетках. Они различаются в зависимости от вируса, вызвавшего трансформацию. Так были обнаружены антигены, специфичные по отношению к вирусу полиомы или к SV-40
Вирусснецифические антигены были открыты в ядре трансформированных клеток и названы Т-антигенами (опухолевыми антигенами). У хомяков с опухолями, индуцированными вирусом полиомы, вырабатываются антитела против специфических по отношению к полиоме ядерных антигенов. Если их пометить флуоресцирующим красителем, то антигены можно будет наблюдать под микроскопом: клетки с Т-антигеном после инкубации с мечеными антителами характеризуются ярким флуоресцирующим ядром, тогда как клетки без антигенов остаются темными.
Т-антиген не является компонентом вируса, таким, как, например, белок его оболочки. Функции его до сих пор не выяснены. Недавние исследования показали, что клетки опухолей, индуцированных вирусами, не всегда содержат Т-антигены. Следовательно, они не обязательны для трансформации.
Вирусспецифические антигены могут также локализоваться на клеточной мембране трансформированных клеток (антигены реакции отторжения при трансплантации — АРОТ). Они ответственны за отторжение пересаженных вирусных опухолей. Как мы видели в предыдущей главе, возможна выработка, правда ограниченного, иммунитета против пересаженных вирусных опухолей. Если попытаться вторично ввести ту же вирусную опухоль резистентному животному, то клетки пересаживаемой опухоли не привьются (при условии,- что вводится не слишком много клеток).
Локализация таких трансплантационных антигенов на клеточной мембране хорошо изучена.
- Общепринято, что трансплантационные антигены располагаются на поверхности клетки. Лишь в этом случае возможна прямая реакция между пересаженными клетками и клетками иммунной защиты.
- Иммунные реакции могут быть вызваны не только интактными трансформированными клетками, но и их «тенями». «Тенями» клеток называют их оболочки с достаточно хорошей сохранностыо поверхностных структур, получаемые при набухании клеток и их разрыве в гипотоническом солевом растворе.
Антигенные вещества самих вирусных частиц (белковые субъединицы) не идентичны АРОТ-антигенам. АРОТ-антигены вырабатываются трансформированной клеткой в соответствии с указаниями, исходящими от вирусного генома. Различные типы клеток вырабатывают одни и те же антигены при трансформации одним и тем же вирусом (см. стр. 167).
Помимо поверхностных антигенов, которые выявляются при трансплантации, имеются также антигены, которые удается обнаружить непосредственно in vitro (проба на агглютинацию- антитела, меченные флуоресцеином). Такие антигены часто называют S-антигенами.
Рассмотрим теперь биологическое значение трансплантационных антигенов. Трансплантация и отторжение трансплантата являются искусственно созданной ситуацией, так сказать, биологически исключительным случаем, возможным лишь в условиях эксперимента. И все же имеются достоверные указания на то, что вирусспецифические вещества типа трансплантационных антигенов играют определенную роль и в «нормальном» развитии вирусной опухоли.
Измененные антигенные структуры опухолевой клетки предупреждают систему иммунной защиты хозяина. Трансформированные клетки рассматриваются как «новые», «чужие», и механизмы защиты приводятся в действие. Под влиянием вируса часть собственных клеток организма становится «чужой», что находит отражение в следующем:
- Клетки, ставшие чужими, выпадают из системы целостного организма: перестав подчиняться правилам «общества», они становятся опухолевыми.
- Но именно из-за того, что клетки стали чужими, хозяин получает возможность отторгнуть их как чужеродный материал.
Согласно этой теории, S-антигены находятся в центре вирусного онкогенеза: чем больше клетки становятся чужими благодаря этим антигенам, тем легче им уклоняться от нормальных регуляторных сигналов. Однако это же обстоятельство ослабляет их позиции по отношению к системе иммунной защиты организма. Взаимосвязь очевидна, хотя и не имеет пока строгого экспериментального подтверждения.
Вирусспецифические антигены не являются единственными «отпечатками пальцев» опухолевых вирусов в трансформированных клетках. Особенно выдают присутствие вируса вирусспецифические рибонуклеиновые кислоты.
По следам «маскированных» опухолевых ДНК-вирусов: вирусспецифические рибонуклеиновые кислоты
Трансформированные опухолевые клетки вырабатывают вирусспецифическую информационную РНК. Выявление этой РНК осуществляется путем так называемой гибридизации ДНК с РНК. Здесь следует совершить небольшой экскурс в теорию, чтобы понять суть этого метода.
Информационная РНК получает генетическую информацию от ДНК, и последовательность нуклеотидов в ней определяется нуклеотидной последовательностью ДНК.
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПРИНЦИП ГИБРИДИЗАЦИИ
ТЕХНИКА ГИБРИДИЗАЦИИ
Следовательно, информационная РНК и ДНК комплементарны друг к другу. Правда, отдельная молекула информационной РНК представляет собой «слепок» лишь с короткого отрезка нуклеотидной цепочки ДНК. Если ДНК и информационную РНК от одной и той же клетки смешать друг с другом, то соответствующие нуклеотидные цепочки двух нуклеиновых кислот вновь объединятся попарно. Такие ДНК — РНК-комплексы могут быть разделены и количественно охарактеризованы. Если же ДНК смешать с информационной РНК из разных источников, то, как правило, будет наблюдаться лишь слабая ассоциация (фиг. 41).
Точно так же информация, заключенная в вирусной ДНК, прежде всего переписывается на молекулу РНК, и эта вирусспецифическая информационная РНК также может быть гибридизирована с вирусной ДНК. Итак, вирусспецифическая информационная РНК — это РНК, гибридизированная с вирусной ДНК.
В опытах по гибридизации вирусной ДНК с РНК из незараженных нормальных клеток спаривания не наблюдается. И наоборот, если выделить РНК из трансформированных клеток и гибридизировать ее с вирусной ДНК, то произойдет частичная гибридизация между РНК и ДНК. И хотя спариванию подлежит лишь очень небольшая часть общей РНК трансформированной клетки, ее связывание с вирусной ДНК определяется с высокой степенью надежности (фиг. 42). Это означает, что вирусспецифическая РНК присутствует даже в трансформированных клетках, хотя сами вирионы в них и не выявляются.
Полученные новые сведения являются прямым указанием на присутствие вирусной ДНК, иначе откуда бы клетке взять информацию для синтеза этой РНК?
Вирусная ДНК сохраняется в трансформированных клетках
О наличии в трансформированных клетках вирусной ДНК свидетельствует не только выявление вирусспецифической информационной РНК- вирусная ДНК была обнаружена и прямыми методами.
Доказательства вновь основываются на методе соединения комплементарных ДНК и РНК. Для этого прежде всего необходимо получить вирусную информационную РНК, которая используется в качестве индикатора вирусной ДНК. Эту РНК можно выделить из смеси информационных РНК клетки и вируса, экстрагированных из информационных клеток.
Вестфаль выбрал более изящный путь: он синтезировал информационную РНК SV-40. С этой целью он использовал фермент, полимеризующий рибонуклеотиды до полинуклеотидов (РНК) в точном соответствии с так называемой «затравочной» ДНК (ДНК-зависимая РНК-полимераза). Последовательность нуклеотидов в такой синтетической РНК оказывается комплементарной последовательности нуклеотидов, используемой затравочной ДНК. Если же в качестве «затравки» взять вирусную ДНК, то можно получить вирусснецифическую РНК.
Такая синтетическая вирусная информационная РНК может быть связана с ДНК клетки, трансформированной опухолевыми вирусами- с ДНК нормальных клеток связывания не происходит. Из этого следует, что вирусная ДНК постоянно присутствует в трансформированной клетке. Таким образом, «маскированный» вирус не что иное, как «голая вирусная ДНК», или «ядро» вирусной частицы. По предварительным подсчетам имеется 10—50 вирусных копий на клетку. Все копии локализуются в ядре клетки. Если вспомнить о том, что трансформация происходит успешнее в те фазы клеточного цикла, когда осуществляется синтез
ДНК, то легко согласиться с предположением о том, что вирусная ДНК встраивается в ДНК клетки-хозяина. При каждом делении клетки вирусная ДНК делится вместе со всей ДНК клетки. В противном случае она должна была бы постепенно исчезнуть и ее нельзя было бы обнаружить.
В самом строгом смысле слова метод гибридизации нуклеиновых кислот доказывает лишь то, что по крайней мере часть вирусной ДНК сохраняется в трансформированной клетке. Новые методы позволяют сделать более широкие обобщения: доказано, что в трансформированной клетке сохраняется весь геном вируса SV-40.
Демаскировка опухолевого вируса: слияние клеток вызывает продуцирование вируса
В последние годы удалось добиться слияния клеток млекопитающих (Эфрусси, Харрис). При этом образуются клетки, имеющие поначалу два или более ядра- через некоторое время формируется одно ядро, которое содержит хромосомы обеих родительских клеток.
В природе такое слияние клеток высших организмов является редкостью. Его возможно наблюдать лишь в особых случаях, когда «суперклетка», возникшая в результате слияния, имеет по сравнению с обычными родительскими клетками преимущество в отборе. Однако такого слияния можно добиться искусственным путем, обработав клетки вирусом Сендай. Этот вирус, названный в честь города в Японии и обычно вызывающий заболевание типа гриппа, способен вызывать также слияние клеток в культурах: по-видимому, он содержит «фактор слияния», который специфически воздействует на клеточные стенки. Слияние клеток может быть вызвано и «мертвым» (инактивированным ультрафиолетовым облучением) вирусом Сендай. В последнем случае устраняется необходимость в «остановке» продуцирования вируса после слияния клеток.
Используя описанный метод, Копровски сумел осуществить слияние целой серии трансформированных клеток (очевидно, без вируса) с нормальными клетками, в которых возможно продуцирование вируса. Продуцирование вируса начиналось в образованных таким образом многоядерных гибридах клеток. Нормальная «продуктивная» клетка превращает «маскированный» вирус трансформированной клетки в продуктивный вирус (см. фиг. 40).
В ходе проводимых экспериментов выяснилось, что:
1) в трансформированных клетках может сохраняться весь геном вируса, поскольку слияние клеток вызывает образование полных вирусных частиц-
2) по-видимому, в трансформированной клетке не происходит каких-то реакций, необходимых для продуцирования полных вирусных частиц. В трансформированной клетке нет синтеза белковой оболочки и соответственно массового производства вирусной ДНК. Поэтому, как можно полагать, трансформированная клетка (по крайней мере в этом отношении) держит вирус под контролем.
