Канцерогенные ароматические амины связываются белками - рак: эксперименты и гипотезы
Канцерогенные ароматические амины связываются белками
Взаимодействие МАБ с метионином свидетельствует одновременно и о связывании азокрасителей белками, но исторически сложилось так, что к этому выводу ученые пришли не сразу. Еще в 1947 г. Миллеры обнаружили, что белок печени крысы, которой скармливали ДАБ, в кислой среде розовеет, а в щелочной вновь обретает желтый цвет. Это окрашивание не исчезало после экстрагирования органическими растворителями- краситель отмывался, оставаясь, впрочем, связанным с аминокислотами лишь после переваривания белка протеолитическими ферментами или после гидролиза горячей щелочью. Разные красители обладают различной интенсивностью связывания. Так, 3-метил-ДАБ связывается гораздо лучше, чем ДАБ, а последний в свою очередь связывается гораздо лучше, чем АБ. Это открытие повлекло за собой постановку двух существенных вопросов: какова химическая природа связывания и имеет ли оно какое- либо отношение к появлению опухолей?
Ответы на первый вопрос были получены лишь после открытия 3-CH3S-MAB и установления возможности реакции между N-бензоилокси-МАБ и другими аминокислотами, кроме метионина. Располагая этой информацией, Лин и Миллеры смогли легко доказать, что в рассматриваемую реакцию вовлекаются главным образом метионин и тирозин. Имеются также сведения об участии в реакции цистеина белка.
Чем сильнее канцероген, тем лучше связывание белками
Вопрос же о том, имеет ли связывание какое-либо отношение к появлению опухолей, сумели разрешить довольно быстро. ДАБ, АБ и З`-метил-ДАБ, например, являются веществами, канцерогенность которых коррелирует с интенсивностью их связывания белками. Испытывались также другие С-монометильные производные ДАБ- оказалось, что скорости, с которыми ДАБ и его 5С-монометильные производные достигают максимального уровня связывания (около четырех недель для ДАБ), превосходно совпадают с канцерогенной активностью этих соединений.
Гипотеза о том, что связывание белками печени служит причинным фактором в развитии экспериментальных гепатом, находит подтверждение не только благодаря упомянутым выше результатам, но и на основании следующих фактов:
а) если к пище крыс вместе с ДАБ добавлять рибофлавин, то наблюдается не только уменьшение числа возникающих гепатом, не и связывания красителей белками-
б) крысы чувствительны к ДАБ, а мыши — нет. У этих двух видов обнаружен и различный уровень связывания ДАБ белками печени-
в) одновременное скармливание 3-метилхолантрена и ДАБ также приводит к подавлению индуцирования гепатом и связывания красителя белками.
Все эти данные свидетельствуют о том, что образование опухолей печени находится в зависимости от того, связывается азокраситель (в частности, ДАБ) белками печени или нет.
Канцерогенные ароматические амины связываются преимущественно h2 -белками
В печени содержится большое число разнообразных белков. Клетка печени должна не только поддерживать свою жизнедеятельность, но и решать целую серию «общественных проблем»: запасать гликоген для снабжения всего организма глюкозой в случае необходимости, принять через воротную вену продукты питания, разложить их и затем вновь собрать. Она ответственна также за часть тепла, вырабатываемого организмом. Для выполнения перечисленных задач необходимы ферменты, а все ферменты — это белки: отсюда широчайший спектр различных белков печени.
Эффективным методом разделения компонентов белковой смеси является электрофорез. Белки различаются по своему электрическому заряду — одни имеют больший отрицательный заряд, другие больший положительный. Известны также белки с суммарным нулевым зарядом. Если белковый раствор поместить в электрическое поле, положительно заряженные белки переместятся к отрицательному полюсу, а отрицательно заряженные — к положительному.
Такое разделение может быть, в частности, произведено на колонке (зональный электрофорез, фиг. 7). Белки, подлежащие разделению, помещают на колонку, заполненную подвергнутой специальной химической обработке целлюлозой, и через колонку пропускают электрический ток. Обычно нижняя часть колонки служит положительным полюсом, поэтому белки тем быстрее опускаются вниз по колонке, чем больше их отрицательный заряд. Спустя некоторый промежуток времени напряжение снимают, но за это время отдельные белковые фракции успевают разделиться по зонам. Затем колонку промывают (элюируют), а содержимое различных зон собирают в отдельные пробирки.
На фиг. 8 показана так называемая диаграмма элюции (вымывания) после электрофореза белков нормальной печени. По оси ординат отложены значения оптической плотности элюата при 280 нм (мера концентрации белка) каждой фракции. Легко заметить, что разделение прошло не полностью: виден перехлест фракций. Характерным пикам была присвоена алфавитная, а недостаточно разделенным, сливающимся пикам — дополнительная цифровая классификация.
Электрофореграмма была снята с белков печени крыс, которым с пищей скармливали канцерогенный азокраситель З`-метил-ДАБ (Зороф). На фиг. 8 показаны результаты этого эксперимента- на графике отложена не только оптическая плотность при 280 нм (концентрация белка), но и оптическая плотность при 525 нм элюата после добавления муравьиной кислоты (концентрация красителя). Красным
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ: ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Фиг. 7.
БЕЛКОВЫЕ ПРОФИЛИ: Н -БЕЛКИ
показана оптическая плотность при 525 нм. Краситель обнаруживается преимущественно во фракциях 130—140, соответствующих так называемым h2 -белкам.
В гепатомах h2 -белков значительно меньше
Аналогичным способом были проанализированы белки опухолей печени. Как оказалось, во всех исследованных гепатомах (не только в гепатомах, вызванных азокрасителями) hi -белки содержатся в значительно меньшей концентрации, чем в здоровой печени. Не составляют исключения и медленно растущие гепатомы Морриса, которые мало отличаются от нормальной печени.
Все сказанное выше позволяет суммировать данные по связыванию канцерогенных красителей белками печени:
а) обнаружена тесная зависимость между канцерогенной активностью и связыванием белками-
б) красители связываются преимущественно определенным классом белков — так называемыми h2 -белками-
в) содержание h 2 -белков и соответственно интенсивность связывания красителя сильно снижены в гепатомах.
Эти данные легко объяснить, исходя из простых допущений:
- Если hi -белки — регуляторы роста, то следует ожидать, что их содержание в гепатомах должно быть снижено.
- Все вещества, которые могут специфически реагировать с этими белками, должны быть канцерогенами.
Вскоре после того как Миллеры открыли связывание азокрасителей белками печени и отсутствие такого связывания белками гепатомы, они сформулировали теорию, ныне известную как «гипотеза исчезновения белка». Согласно этой теории, опухолевые клетки отличаются от нормальных тем, что в них отсутствуют вещества, регулирующие нормальный рост. Следовательно, злокачественное превращение клетки печени можно, по-видимому, объяснить исчезновением /i-белков. Из такого вывода непосредственно исходит следующая предпосылка для эксперимента: если h-белки и в самом деле регуляторы роста, то возможно подавить рост некоторых клеток, изготовив препараты из этих белков.
h2 -Белки подавляют рост клеточных культур (in vitro)
Впервые эту попытку предпринял Зороф. Используя клетки Не La (клетки опухоли человека) и L-клетки (полученные из фибробластов мыши), он добавлял к их культурам обогащенные h2-белками фракции. Рост клеток действительно подавлялся. Более того, подавление было обратимым: как только /i-белки отмывали, клетки начинали расти с прежней скоростью. Последнее обстоятельство исключало тривиальное допущение о том, что Л-белки просто токсичны и убивают клеточные культуры.
Эксперимент Зорофа знаменовал собой достижение апогея в истории с h2-белками. Судя по всему, h2-белки играют решающую роль в превращении нормальной клетки в опухолевую. Но вслед за тем появились возражения :h2-белки должны подавлять рост только клеток печени, ведь регулятор роста печени должен быть для них специфичен. Однако ни Не La, ни L-клетки не относятся к клеткам печени. Ученые заподозрили, что обнаруженное Зорофом подавление вызывается какой-то более простой причиной. И действительно, позже было обнаружено, что ингибиторное действие h2-белков вызвано наличием в них аргиназы. Этот фермент расщепляет необходимый для роста клеток аргинин, находящийся в питательной среде, и в результате клетки голодают. Добавление аргинина компенсировало ингибиторное действие /z-белков.
Этим дело не ограничилось: особая роль h2-белков подверглась сомнению, так как выяснилось, что в ядре клетки канцерогенные красители связываются главным образом альбуминоподобными белками. Более того — и это нанесло поистине тягчайший удар гипотезе связывания белками,— оказалось, что канцерогенные амины реагируют и с нуклеиновыми кислотами (Маррокэн и Фарбер, Робертс и Уорвик). Здесь мы сталкиваемся с проблемой: какие же реакции стратегически важны — реакции связывания белками, РНК или ДНК? Бесспорно, львиная доля связывания происходит за счет /z-белков. По-видимому, их высокую специфичность можно объяснить, не прибегая к чересчур хитроумным приемам, лишь так: /z-белки и активирующие ферменты должны быть идентичными- активированные, реакционноспособные производные азокрасителей должны вступать во взаимодействие со своими ближайшими партнерами, то есть именно с этими ферментами. Однако до сих пор эта гипотеза не нашла подтверждения (Зороф, Кеттерер). Нам остается лишь констатировать, что сейчас мы не располагаем сколько-нибудь удовлетворительными объяснениями возможной функции h2-белка.
Связывание канцерогенов ДНК вряд ли играет какую- либо роль в количественном отношении, но оно отлично «вписывается» в теоретические схемы современной биологии. Замечательная способность опухолевых клеток «постоянно порождать опухолевые клетки» даже в отсутствие внешнего канцерогена легко объясняется: любое изменение генетического материала (ДНК) неизбежно передается дочерним клеткам. Тем самым опухолевые клетки должны генетически отличаться от нормальных клеток: таков, казалось бы, очевидный вывод. Но, по сути, это всего лишь удобный вывод. Дальнейшие замечания и более свежие сведения по ДНК и раку приведены в отдельной главе, специально посвященной этому вопросу (стр. 238).
Заключение
Канцерогенные ароматические амины (N,N-диметил- 4-аминоазобензол и другие аминоазокрасители, бета-нафтиламин, бензидин, 2-ацетиламинофлуорен), активируются до эффективных форм посредством гидроксилирования. Эта реакция может протекать как по ароматическому кольцу, так и по аминогруппе. Реакция N-гидроксилирования, по- видимому, играет самую важную роль: N-оксиамины (амиды) в большинстве случаев более сильные и более многосторонние канцерогены, чем исходные амины- Миллеры назвали их «непосредственным канцерогеном». Продукты этерификации N-оксиамидов взаимодействуют in vitro с компонентами клетки, такими, как метионин. И в самой клетке эфиры сульфатов могут быть активной формой канцерогенных ароматических амидов. В тех случаях, когда амины оказываются более канцерогенными, чем соответствующие амиды, или в случае, когда у животных амиды не обнаружены, «окончательным канцерогеном», видимо, оказывается N-оксиамин.
Канцерогенные ароматические амины связаны преимущественно особым классом растворимых белков (h -белки). Канцерогенность и связывание белками хорошо коррелируют друг с другом, а содержание h -белков оказывается резко сниженным в гепатомах. Согласно «гипотезе исчезновения», h-белки обладают регуляторным воздействием на рост. Потеря клеткой h-белков должна быть непосредственной причиной неконтролируемого роста опухолей. И действительно, обработка клеточных культур препаратами h-белка ведет к обратимому подавлению роста. Однако загрязняющий препараты фермент аргиназа оказался активным компонентом, поскольку он разрушает аргинин, необходимый для роста клеток.
Канцерогенные ароматические амины взаимодействуют не только с белком, но и с нуклеиновыми кислотами. Связывание канцерогена ДНК сегодня рассматривают как решающий фактор канцерогенеза.
