Изучение рака, вызываемого каменноугольной смолой - рак: эксперименты и гипотезы

Первый шаг: изучение рака, вызываемого каменноугольной смолой
Выявить истоки науки во многих случаях весьма затруднительно. Это сложно сделать даже при изучении истории экспериментальных исследований рака, однако, по- видимому, следует все же выделить как особую дату 1775 год: именно тогда французский врач Бернар Пейрийе привил собакам опухоли человека и вызвал новые «разрастания». Академия наук и изящных искусств в Лионе наградила исследователя первой премией за участие в конкурсе работ по изучению «причин вируса рака». Однако и усердный врач, и академия пали жертвой заблуждения: разрастания были не истинными опухолями, а лишь гнойниками- воспалительные отеки трудно было отличить от злокачественных опухолей без микроскопа и соответствующей бактериологической техники.
В том же году английский врач Персиваль Потт опубликовал сообщение о раке мошонки у трубочистов. Эти больные еще в детском возрасте вынуждены были лазить по узким дымоходам и очищать их от скопившейся копоти. Потт пришел к выводу, что имеет дело со злокачественными опухолями, и, таким образом, был первым, кто поставил диагноз рака как профессионального заболевания. Более того, он документально доказал, что рак может быть вызван внешним воздействием. «Причинным агентом» в изученном им случае, по-видимому, была сажа, то есть мельчайшие частички угольной пыли, слипающиеся благодаря каменноугольной смоле.
Через 100 лет после Потта немецкий врач Фолькманн обнаружил, что каменноугольная смола и сама по себе способна вызывать рак. Обследуя рабочих, занятых на производстве смолы, он установил, что рак возникал главным образом на коже кистей рук и предплечий. Но на протяжении почти полутора веков после Потта никому не удалось вызвать рак у животных. И лишь в 1915 г.
японские ученые Ямагива и Ишикава сообщили о том, что индуцировали настоящие опухоли, нанося каменноугольную смолу на кожу ушей кролика. И хотя критики и завистники считают это сообщение лишь дальнейшим подтверждением хорошо известного факта, по существу японские ученые сделали первый шаг в экспериментальных исследованиях злокачественных опухолей.

Экспериментальные исследования опухолей до Ямагивы

Ранее было известно, как трансплантировать спонтанные опухоли подходящим животным-реципиентам, и ученые приступили к исследованиям свойств и поведения «искусственных» опухолей. Некоторые из первых перевиваемых опухолей, в частности саркома Иенсена, до сих пор служат тест-объектами во многих институтах, где ведутся исследования рака. Однако в основном все эти опухоли принадлежат к числу спонтанных- они возникают самостоятельно у животного и далее могут расти не только у того животного, у которого возникли, но также у любого количества животных, которым будут перевиты. Иными словами, их можно рассматривать как живые препараты из патологического музея, а не как репрезентативные примеры опухолевого роста. Помочь в разрешении вопроса, как и почему возникает опухоль, они не могут.
А между тем именно этот вопрос занимал умы многих патологов минувшего века. Среди попыток дать объяснение этому процессу следует выделить следующие:

1.  Вирхов в своей работе &lsquo-&lsquo-Die krankhaften Geschwiilste&rdquo- (1863) настаивал на том, что рак в конечном итоге возникает в результате раздражения- при этом он ссылался на случаи, описанные Поттом.
2.  Конгейм и Рибберт постулировали, что в организме сохраняются остатки эмбриональной ткани, которые могут послужить причиной возникновения злокачественной опухоли.
3.  И наконец, многие ученые допускали, что опухоли вызываются паразитами.

Фольке Хеншен, шведский патологоанатом и свидетель описываемых событий, в своей лекции, посвященной памяти Ямагивы, так описывал всеобщее настроение: «Бурный прогресс в микробиологии к концу XIX в. побудил многих ученых искать причину всех типов рака в инфекции бактериями, грибками, водорослями и простейшими или же в инвазии животными паразитами различной природы... Я хорошо помню, как в Париже престарелый французский ученый Боррель отвел меня в сторонку, надеясь убедить в значении аскарид как канцерогенного фактора... Вскоре первоначальная паразитарная гипотеза была забыта, однако затем она возродилась вновь, но на сей раз, как мы знаем, в обличии вирусной гипотезы».
Этого возрождения не пришлось долго ждать: первые вирусные опухоли были открыты уже с 1908 и в 1910 гг., но официальная наука, занимающаяся исследованиями рака, не придала этому значения.
На пороге текущего столетия особый успех выпал на долю гипотезы Конгейма — Рибберта: &bdquo-Мне приходилось слышать, как патологоанатомы несколько высокомерно высказывались о «старой» теории раздражения Вирхова как о теории, отошедшей в прошлое&rdquo-.
Между тем теория раздражения Вирхова послужила стимулом к многочисленным попыткам исследователей вызвать рак экспериментально путем использования «внешнего раздражителя». Попытки оказались безуспешными. «Все эти неудачи создали у многих капитулянтское настроение,— суммировал Хеншен.— Казалось, что рак так и не удастся постигнуть».
В этих условиях нетрудно себе представить, с каким облегчением встретили ученые в 1915 г. сообщение Ямагивы и Ишикавы «Экспериментальное исследование атипической эпителиальной пролиферации».

Ямагива и Ишикава индуцируют первые экспериментальные опухоли

Оба японских ученых прибегли к чрезвычайно простому методу: два-три раза в неделю стеклянной палочкой они наносили каменноугольную смолу на внутреннюю часть уха кролика. В месте смазывания смолой лишь спустя три месяца возникли бородавчатые разрастания. Затем эти разрастания увеличились и в конце концов почти полностью превратили ухо животного в раковую опухоль.
Удача и терпение сыграли здесь равную роль: только продолжительное нанесение каменноугольной смолы позволило ученым индуцировать папилломы и карциномы. Но используй они в своих опытах собак или морских свинок, даже поистине нечеловеческое терпение не дало бы результатов.
Вскоре выяснилось, что простое смазывание спинок мышей также приводит к образованию опухолей — доброкачественных и злокачественных. Это открытие существенно облегчило работу экспериментаторов: ведь мыши гораздо меньше кроликов и содержать их легче, что позволяет использовать большее число животных. Кроме того, значительно сокращалось время, нужное для возникновения опухоли. Все, вместе взятое, привело к тому, что мыши стали стандартными животными в изучении рака- Национальный институт рака в США даже стали иногда в шутку называть «Национальным мышиным институтом».
Следующий вопрос, который стал перед учеными, напрашивался сам собой: какие же вещества в смоле являются подлинным индуктором опухолей? Несмотря на то что мыши представляли собой «удобный» экспериментальный материал, казалось, что к этому вопросу нельзя подступиться, ибо химия смол находилась еще в зачаточном состоянии, и в основном было известно, что смола является смесью большого числа различных веществ. К сожалению, трудность заключалась не только в этом: для того чтобы изучить канцерогенные свойства частично очищенных фракций смолы, приходилось ждать месяцами, прежде чем сделать вывод о том, является ли данная фракция активной. Да и сам процесс многоступенчатой очистки, которая обычно используется при изучении сложных смесей, невероятно трудоемкий.

Несколько граммов 3,4-бензпирена из 2 т смолы

Несмотря на указанные трудности, англичане Кук, Хьюитт и Хайджер сделали попытку выделить чистый канцероген из каменноугольной смолы. Помимо терпения, эти ученые обладали и смелостью: не полагаясь на биологические тесты, которые потребовали бы месяцев ожидания, они использовали физико-химические характеристики. Уже тогда было известно, что все изученные смолы имеют одинаковый спектр флуоресценции. Это обстоятельство приобрело особое значение, когда выяснилось, что почти такой же спектр имеет и чистое соединение —

7,12 - ДИМЕТИЛБЕНЗАНТРАЦЕН	АНТРАЦЕН
3,4- БЕНЗПИРЕН	1,2 - БЕНЗПИРЕН
1,2:5,6 - ДИБЕНЗАНТРАЦЕН	1,2:3,4 - ДИБЕНЗАНТРАЦЕН
3-МЕТИЛХОЛАНТРЕН	ХРИЗЕН
УМЕРЕННЫЕ И СИЛЬНЫЕ КАНЦЕРОГЕНЫ	СЛАБОКАНЦЕРОГЕННЫЕ ИЛИ НЕАКТИВНЫЕ
ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ	УГЛЕВОДОРОДЫ

1. бензантрацен. Поэтому английские ученые могли рассчитывать на то, что им удастся выделить чистое соединение, которое в случае большого везения окажется канцерогеном.

На газовом заводе по просьбе Кука подвергли фракционной перегонке 2 т смолы. После многократной перегонки, кристаллизации и приготовления характерных производных ученым удалось выделить 50 г (выход 2,5 • 10~6 %!) какого- то им не известного соединения. Это был 3,4-бензпирен, который, как было установлено биологическими тестами, оказался вполне пригодным для исследований канцерогеном.
Но 3,4-бензпирен не относится к числу самых первых чистых канцерогенов. В 1929 г. Кук уже синтезировал 1,2,5,6-дибензантрацен (ДВА), который также оказался активным канцерогеном.
Оба соединения — и 3,4-бензпирен и 1,2,5,6-дибензантрацен — принадлежат к классу полициклических углеводородов. Представители этого класса содержат в качестве основного строительного блока бензольные кольца, которые могут быть объединены в многочленные кольцевые системы в различных сочетаниях (фиг. 3).

Полициклические углеводороды способны вызывать опухоли не только на коже

Однократная подкожная инъекция 7,12-диметилбензан- трацена (ДМБА), 3,4-бензпирена (БП) и других канцерогенных углеводородов ведет после довольно длительного латентного периода (3—4 месяца, в зависимости от дозы) к развитию саркомы. В этих опытах крысы оказались значительно более чувствительными, чем мыши.
При подкожном введении ДМБА только что родившимся мышам возникают многочисленные лимфомы (опухоли лимфатических желез), а обычные саркомы в месте введения обнаруживаются редко. У мышей опухоли яичников образуются в тех случаях, если им скармливают ДМБА, вводят его внутрибрюшинно или просто смазывают спину- у крыс же такая обработка вызывает рак молочной железы. Как у крыс, так и у мышей многократное внутривенное введение ДМБА, кроме того, ведет к развитию различных лейкозов. После скармливания БП наблюдаются опухоли желудка и легких, а также лейкозы. У хомячков после нанесения на кожу ДМБА возникают злокачественные меланомы (опухоли из меланоцитов — клеток, синтезирующих пигмент).
Как ни парадоксально, полициклические углеводороды способны и подавлять развитие рака: так, 3-метилхолантрен (MX) блокирует экспериментальное индуцирование опухолей печени З-метил-4-диметиламиноазобензолом и 2-флуоренилацетамидом. Миллер и Миллер, подробно изучая этот эффект, установили, что  MX индуцирует микросомальные ферменты в печени, которые, по-видимому, превращают эти канцерогенные амины в неактивные производные.
Подобно многим канцерогенам, полициклические углеводороды токсичны: слишком большая доза убивает подопытных животных. Но даже у выживших животных часто заметен токсический эффект: некротические участки на коже в месте нанесения, некроз коры надпочечника. Возможно, что токсический эффект играет важную роль и в канцерогенезе, но к этому вопросу мы еще вернемся.

Теории химического механизма канцерогенеза, вызываемого углеводородами

Из большого числа известных полициклических углеводородов лишь немногие являются канцерогенами. Сам бензол, нафталин, антрацен и фенантрен не канцерогенны. Что же касается 3,4-бензпирена и 1,2,5,6-дибензантрацена, Td4 они довольно сильные канцерогены. (3,4-БП играет особую роль в окружающей человека среде: остатки сгорания нефти, выхлопные газы, пыль на улицах, свежая земля в поле, дым сигарет и даже копченые продукты содержат в некоторых случаях существенное количество этого канцерогенного углеводорода.) Как ни удивительно, 1.2-бензпирен и 1,2,3,4-бензантрацен, структурно очень сходные с этими двумя соединениями, не являются канцерогенами (см. фиг. 3). Замещенные углеводороды — 3-МХ, ДМБА и 9,10-диметилантрацен — особенно активны, тогда как 1,2-бензантрацен весьма мало активен, а антрацен, как мы уже отмечали, и вовсе неактивен.
Чем же вызваны эти различия? Вполне возможно, что неодинаковой химической активностью этих соединений. Иными словами, химически активные вещества могут быть канцерогенами. Основные типы реакций, которые следует рассмотреть,— реакции присоединения и замещения- реакции присоединения особенно важны для объяснения природы канцерогенной активности. В качестве примера рассмотрим реакцию полициклических углеводородов с четырехокисью осмия:

Механизм реакции полностью не изучен, но для упрощения можно сказать, что имеющаяся в этом соединении двойная связь обеспечивает начало реакции. Двойные связи, которые вступают в реакцию легче, чем другие аналогичные связи в данном соединении, часто называют «К-районами». Приводимая ниже таблица подтверждает гипотезу о том, что химическая и канцерогенная активности коррелируют друг с другом (табл. 1).
Таблица 1
Реакция присоединения в К-районе и канцерогенная активность

Правда, ограниченность такого простого сравнения бросается  в глаза: 1,2-бензантрацен, будучи весьма активным, тем не менее не обладает канцерогенной активностью. И все же мысль о связи химической и канцерогенной активности не следует отбрасывать. Нужно учитывать, что скорость связывания четырехокиси осмия отражает лишь часть широкого спектра возможных химических реакций, в которые может вступать данное соединение.
В теории Пульмана, например, дается существенное дополнение по так называемым Л-районам (то есть районам с активными атомами, находящимися в пара-положении):
согласно теории, только комбинация «активного К-района» с «неактивным JI-районом» обеспечивает соединению способность вызывать опухоли.
В последнее время идея о том, что эпоксид1 канцерогенного углеводорода может оказаться необходимой промежуточной химически активной формой, получила широкое распространение (Симс, Гельбойн, Хайдельбергер). Такие эпоксиды представляют собой более эффективные трансформирующие агенты в тканевых культурах, чем углеводороды, из которых они образуются, и в то же время они in vivo не более эффективны. Несмотря на сложность проблемы, изучение эпоксидов, по-видимому, окажется наиболее многообещающим подходом к выяснению химически активных форм углеводородов.
Хотя непосредственное определение химической активности многих возможных промежуточных химических продуктов кажется заманчивым, это непрактично. Расчеты волновой механики с помощью карандаша, бумаги или вычислительной машины позволяют вычислять параметры, которые качественно характеризуют соответствующую химическую активность изучаемого углеводорода. Эти расчеты получили название «волновой» теории химического канцерогенеза. Однако в каждом отдельном случае мы лишь постулируем, что для канцерогенеза необходим данный тип химической реакции, и пытаемся связать канцерогенную активность с подсказанной расчетами возможностью химического соединения вступать в эту реакцию.

Полициклические углеводороды связываются белками

В ультрафиолетовом свете полициклические углеводороды дают сильную флуоресценцию от бело-голубой до бело-желтой. Используя этот высокочувствительный метод определения, Е. Миллер в 1951 г. пришел к выводу, что 3,4-бензпирен в коже мыши связывается белками. Его опыты были продолжением более ранних экспериментов, в которых удалось обнаружить связывание канцерогенных азокрасителей белками печени (см. стр. 55). Очевидно, канцерогены связываются белками именно того органа, в котором они индуцируют опухоль.
занись двухатомного спирта. — Прим. перев.
Хайдельбергер продолжил эксперименты, пользуясь радиоактивными углеводородами. Полученные результаты на первый взгляд оказались разочаровывающими: растворимыми белками кожи связывались не только канцерогенные, но и неканцерогенные углеводороды. Это означало, что реакцию связывания канцерогена белками нельзя считать основополагающей в канцерогенезе. Однако новые опыты еще раз пробудили интерес к «связыванию белками»:Абель и Хайдельбергер разделили растворимые белки кожи мыши при помощи электрофореза в крахмальном геле и обнаружили, что канцерогенные углеводороды преимущественно связывались определенной фракцией слабоосновных белков, в то время как неканцерогенные соединения связывались большим числом различных фракций.
Проведенные опыты позволили существенно расширить химическую теорию возникновения опухолей: очевидно, что важна не только химическая активность канцерогена, но и химическая активность его партнера по реакции, в данном случае определенного класса белков.

Белки могут быть регуляторами роста

Миллеры уже высказывали предположение, что азокрасители связываются не всякими белками, а лишь теми, которые регулируют рост. Приняв эту гипотезу за основу, мы можем построить очень простую модель раковой клетки: потеря вещества, регулирующего рост, автоматически вызывает неконтролируемые деления клетки. Канцерогены дезактивируют «регуляторные» белки- последние в свою очередь не могут быть заменены. Так возникают опухолевые клетки, в которых эти белки постоянно отсутствуют. Еще 20 лет назад подобное объяснение ни у кого не могло вызвать недоумения, поскольку в то время многие полагали, что именно белки ответственны за собственное воспроизводство (белковая матрица в синтезе белка). Однако, по мнению современных ученых — мнению, по существу ставшему догмой,— за воспроизводство специфической структуры белков ответственны нуклеиновые кислоты. Тем самым белки оказались спущенными на второй уровень в клеточной иерархии. Но в таком случае почему бы канцерогенам не реагировать с нуклеиновыми кислотами, особенно с ДНК?

Полициклические углеводороды реагируют и с ДНК

Длительное время исследователям не удавалось продемонстрировать связывания канцерогенных углеводородов с ДНК в коже мыши. Объяснялось это довольно просто: связыванию подлежит относительно небольшое число молекул, которые могут быть выявлены лишь с помощью соединений, обладающих высокой радиоактивностью. Но даже в этом случае следует крайне тщательно проводить процедуру измерения, чтобы обнаружить чрезвычайно низкий уровень излучения.
Брукс и Лоули первыми окончательно доказали, что полициклические углеводороды связываются ДНК. Кроме того, они обнаружили, что связывание и канцерогенная активность коррелируют друг с другом, хотя Гошмен и Хайдельбергер не смогли в полной мере воспроизвести указанную корреляцию. На реакции связывания канцерогена ДНК мы остановимся в специальной главе (стр. 238), поскольку она требует подробного обсуждения. А сейчас обратимся к другому классу химических канцерогенов — ароматическим аминам.

Заключение

Первые экспериментальные опухоли при помощи химического вещества вызвали Ямагива и Ишикава (рак у кроликов, спровоцированный каменноугольной смолой, 1915 г.). Было показано, что основным канцерогенным фактором смолы являются полициклические углеводороды, среди которых находятся хорошо известные 3,4-бензпирен и 3-метилхолантрен. Но не все полициклические углеводороды обладают канцерогенной активностью- небольшие изменения в структуре молекулы способны подавлять канцерогенную активность (ср. 3,4-бензпирен и 1,2-бензпирен).
Были сделаны также попытки установить связь между канцерогенной и химической активностью этих углеводородов. Однако, помимо химической активности, следует  принимать во внимание и реакционную способность партнера по реакции- такими потенциальными партнерами могут быть белок, РНК и ДНК.
Какие компоненты смолы вызывают рак, известно довольно хорошо, но как они это делают, далеко не ясно.