Многоступенчатая гипотеза химического канцерогенеза - рак: эксперименты и гипотезы

Со времени первых исследований Ямагивы на ухе кролика кожа не раз становилась объектом изучения искусственно вызванного канцерогенеза. Причины тому очевидны: за кожей легко наблюдать, с ней легко работать, а для нанесения любого канцерогенного вещества достаточно простой пипетки. Не менее важно и то обстоятельство, что развитие опухолей можно наблюдать визуально. Нет необходимости в пальпации или аутопсии- внимательного наблюдения достаточно, чтобы установить, возникли опухоли на спинке мыши или на ухе кролика (и если да, то сколько).

Эксперимент Беренблюма — Моттрама: два этапа в развитии папиллом

Для индуцирования опухолей кожи обычно достаточно нанести 0,1 мл 0,3%-ного раствора метил холантрена, бензпирена или диметилбензантрацена (ДМБА) в ацетоне на выбритые спинки мышей по одному или нескольку раз в неделю. Можно даже вызвать папилломы и карциномы одной большой дозой, хотя процент образования опухолей при этом будет весьма низким. Помимо «классических» методов, существуют и более тонкие способы образования опухолей кожи:

1.  Мышам наносят на кожу или скармливают канцерогенный углеводород (25 мкг на спинку или 1 мг при скармливании) в дозе, недостаточной для индуцирования опухолей на протяжении нормального жизненного цикла подопытных животных.
2.  После этого мышам еженедельно наносят на спинку 0,5%-ный раствор кротонового масла (масло семян тропического растения Croton tiglium). Примерно через восемь недель начинают визуально обнаруживаться первые папилломы. Если кротоновое масло наносят без предварительной обработки животного канцерогеном, то опухоли не возникают. Следовательно, кротоновое масло в этих условиях не является канцерогеном.

Эксперимент впервые был осуществлен Моттрамом, а позднее усовершенствован и в больших масштабах поставлен Беренблюмом. Было показано, что комбинация двух неканцерогенных компонентов может привести к возникновению опухолей:
Субпороговая единичная доза канцерогена +
+ Неканцерогенное кротоновое масло ------------------------------------- Опухоль.
Напрашивается сравнение с процессом фотографирования: как известно, после экстенсивной экспозиции свет вызывает изображение на светочувствительной пластинке. Однако обычно пластинку экспонируют лишь в течение очень короткого промежутка времени («субпороговая доза»), чтобы вызвать появление скрытого изображения, а затем происходит химическое проявление активированных зерен соли серебра до видимых зерен металлического* серебра. Следовательно, в принципе субпороговое освещение в сочетании с химическим проявлением приводит к тому же конечному результату, что и экстенсивная экспозиция сама по себе.
Все сказанное позволяет интерпретировать эксперимент Беренблюма — Моттрама следующим образом: ДМБА или какой-то другой канцерогенный углеводород индуцирует возникновение скрытых опухолевых клеток, которые затем проявляются и под воздействием кротонового масла образуют опухоль. Возникновение скрытых опухолевых клеток обычно называют инициацией, а индуцирование подлинной большой опухоли — промоцией1. Инициацию можно уподобить субпороговому освещению фотопластинки, в то время как активация (эффект кротонового масла) соответствует ее химическому проявлению.
Если мы сначала проявим фотопластинку и лишь затем подвергнем ее воздействию света, изображения, разумеется, не будет. Беренблюм поставил аналогичный эксперимент с кротоновым маслом и канцерогенным углеводородом и обнаружил, что оба компонента при воздействии в обратной последовательности не ведут к образованию опухолей.
*Термин «промоция», что означает «подстрекательство», очень удачно отражает процесс, но не принят в отечественной научной литературе. Советские ученые (Р. Е. Кавецкий) эту фазу канцерогенеза называют «активацией». — Прим. ред.

Активатором может быть не только кротоновое масло

Хотя кротоновое масло и привело к открытию активации латентных опухолевых клеток, оно вовсе не является единственным веществом, способным к этому. Такое же действие могут оказывать моющее средство «Твин», антралин (1,8,9-3-оксиантрацен) и различные фенолы. «Полные канцерогены», по-видимому, могут и инициировать, и активировать (например, канцерогенные углеводороды), но при однократной низкой дозе их эффект ограничивается инициацией.
Приведенная гипотеза позволяет предсказать существование веществ, способных только инициировать, но не активировать,— их можно рассматривать как добавления к кротоновому маслу. Такое вещество было открыто: им оказался уретан (этилкарбамат), который является чистым инициатором для кожи мыши. У мышей, спинки которых обработали уретаном и в течение нескольких недель смазывали кротоновым маслом, замечено образование папиллом. Один же уретан, даже при продолжительном нанесении, не вызывает развития опухолей кожи. Итак, можно индуцировать опухоли комбинацией двух явно неканцерогенных веществ.

Раздражение и канцерогенез

А теперь проследим, каким образом Беренблюм дошел до этой гипотезы. Он начал вовсе не с количественных соответствий латентных периодов и «выхода» опухолей- его просто заинтересовал вопрос: имеет ли раздражение, как таковое, какое-либо отношение к канцерогенезу?
Большинство канцерогенов принадлежит к числу веществ, которые в достаточно больших дозах вызывают раздражение ткани, так что это не был праздный вопрос. Многие ученые не сомневались, что между раздражением ткани и появлением опухоли имеется явная зависимость. Раздражение кожи проявляется гиперплазией (см. фиг. 52): рост числа клеточных делений призван компенсировать утрату поврежденных клеток. Таким образом, вопрос, поставленный Беренблюмом, можно сформулировать так: имеет ли гиперплазия какое-либо отношение к канцерогенезу? Вот что пишет по этому поводу сам исследователь:
«Сначала мы проверили на канцерогенность различные простые раздражители. Все они вызывали гиперплазию кожи мышей, но не образование опухолей. Очевидно, раздражение само по себе не способно к канцерогенному эффекту.
Затем мы применили различные неканцерогенные раздражители совместно с канцерогеном, чтобы выяснить, не усиливается ли от дополнительного раздражения канцерогенный эффект. Результаты оказались обескураживающими. Одни раздражители, особенно горчичный газ (иприт — отравляющее вещество, использованное во время первой мировой войны) и кантаридин, при нанесении в сильно разведенных растворах, способных лишь вызвать очень слабое кожное раздражение, резко ослабляли канцерогенный эффект (то есть проявляли антиканцерогенное воздействие), в то время как другие раздражители, особенно кротоновое масло, резко усиливали канцерогенный эффект (то есть оказывали коканцерогенное действие). Большая же часть раздражителей вообще не оказывала никакого воздействия. Поэтому казалось, что раздражение не является решающим фактором в канцерогенезе даже в том случае, если"имеются другие, более действенные факторы».
Тем не менее Беренблюм решил сделать еще одну попытку:
«На следующем этапе, проводя общий курс обработки подопытных животных канцерогеном, мы заменили канцероген неканцерогенным раздражителем лишь на короткий период... В качестве раздражителя использовали кротоновое масло. Как оказалось, при нанесении этого вещества на протяжении нескольких месяцев перед обработкой канцерогеном ни ускоренного развития опухолей, ни повышения «выхода» опухолей не наблюдалось, между тем как при нанесении после неполного курса канцерогенной обработки «выход» опухолей резко повысился».
Этот эксперимент непосредственно предшествовал (по протоколу) эксперименту Моттрама, который в качестве последнего логического звена в развитии экспериментальных систем позволил сделать следующий вывод: возникновение рака кожи — процесс двухступенчатый. Опухоли легкого также могут быть индуцированы в ходе процедуры, которая, по крайней мере технически, состоит из двух этапов. Однако, прежде чем вплотную перейти к рассмотрению этой экспериментальной процедуры, вернемся еще раз к вопросу, который с самого начала задал Беренблюм: имеет ли раздражение какое-либо отношение к канцерогенезу, или (в особом случае эксперимента с раком кожи) имеет ли гиперплазия какое-либо отношение к возникновению опухолей?
Но этот вопрос следует сформулировать точнее: мы должны различать, имеет ли гиперплазия что-либо общее с инициацией или активацией. Опыты с уретаном дали по
крайней мере один ясный ответ: гиперплазия отнюдь не является необходимой для формирования скрытых опухолевых клеток. После скармливания животным уретана не наблюдалось ни повреждения эпидермиса, ни соответствующих репаративных процессов.
Что же касается активации, то здесь получены не столь четкие результаты. Поэтому работы Геккера с сотрудниками приобрели особую важность: исследователям удалось изолировать и выявить структуру нескольких активных компонентов кротонового масла. При использовании одного из этих компонентов (названных Геккером ТПА) оказалось возможным провести эксперименты по двухэтапному канцерогенезу на четкой количественной основе. Выяснилось, что ТПА не только активатор, но и сильный воспалительный (2 мкг ТПА, нанесенных на спинку мыши, вызывают большую отслойку эпидермиса и отек кожи), а также гиперпластический фактор.
С использованием форболовых эфиров в решении рассматриваемой проблемы появились новые возможности: подробное знание молекулярной структуры этих веществ позволяет производить в их молекулах вполне конкретные перестройки и таким образом выяснить, какие компоненты сложной молекулы определяют ее биологическую активность. В такого рода экспериментах можно выявить соединения, которые обладают либо только воспалительным, либо только активирующим действием. С другой стороны, «чистые» агенты с «чисто» коканцерогенным действием до сих пор также не были известны.

Раус обнаруживает двухступенчатый процесс в опытах на ушах кролика

К тому времени (1941), когда Беренблюм опубликовал данные своих первых экспериментов о применении кротонового масла на коже мыши, Раус сообщил об опытах, проведенных на ушах кролика, которые позволили ему сделать те же выводы. Его наблюдения сводились к следующему:

1. При обработке ушей кролика каменноугольной смолой развиваются опухоли. Если обработку прервать, то во многих случаях опухоли исчезают. Если же снова начать обработку смолой, то опухоли возникают в тех же местах.
2. Повторная обработка смолой не была единственным фактором, который пробуждал «дремлющую» опухоль: этому способствовала также обработка скипидаром или хлороформом, которые сами по себе не являются канцерогенами. Опухоль возникала и в процессе заживления раны. Проткнув штопором дырку в ухе животного, Раус вызывал развитие опухоли в ране.

И вновь был сделан вывод, что образованию опухоли способствуют по крайней мере два процесса:
а) индуцирование «дремлющих» опухолевых клеток-
б) размножение этих «дремлющих» клеток и формирование из них опухоли в результате неканцерогенного процесса.

Кротоновое масло нельзя считать «химическим штопором»

Сделанное Раусом наблюдение о том, что простое заживление раны после механического повреждения существенно ускоряет рост опухоли, казалось бы, должно было натолкнуть ученых на мысль рассматривать кротоновое масло в качестве своеобразного «химического штопора». Иными словами, кротоновое масло следовало считать причиной образования раны, заживление которой есть не что иное, как коканцерогенный процесс. Однако такой концепции противоречат данные о том, что многие вещества, вызывающие воспаление и способствующие развитию регенеративной гиперплазии («заживление раны»), не являются коканцерогенами.
Морфологическое изучение кожи, обработанной ТПА, также указывает на специфический эффект: прежде всего не происходит образования раны, а следовательно, разрушения клеток эпидермиса. Сначала набухают базальные клетки, в том числе и их ядра, а затем происходит интенсивное размножение клеток (гиперплазия). Многократные деления клеток не направлены на заживление раны- клетки продолжают делиться даже при отсутствии раны. Настоящая рана образуется позднее, когда отторгается целый слой кожи.

Для воссоздания полной картины недостаточно двух стадий

Баутвеллу удалось еще полнее разделить фазу активация — развитие скрытых опухолевых клеток. С этой целью мышей первоначально обрабатывали ДМБА, а затем кротоновым маслом и скипидаром. Детали эксперимента приведены на диаграмме (фиг. 12).
Итак, скипидар может воспроизводить некоторые эффекты кротонового масла, но поздние, а не ранние. Другими словами, он, по-видимому, способен довести активацию до конца, хотя начинать ее не может. Для первой стадии активации Баутвелл предложил термин «конверсия». Тем самым он подчеркивал, что на этой стадии потенциальные опухолевые клетки превращаются в подлинные «дремлющие» опухолевые клетки, которые позднее, размножаясь, дадут опухоль. Судя по всему, специфическая гиперплазия или заживление раны дают толчок к размножению клеток, но не к их превращению.

Активация обратима

Совсем небезразлично, через какие интервалы времени обрабатывать мышь кротоновым маслом. Если суммарную дозу (1,5 мг) давать крайне малыми единичными дозами и часто или же обычные эффективные дозы давать с очень большими перерывами, то, согласно Баутвеллу, в обоих случаях будет наблюдаться выраженное снижение процента образования опухолей.
Это значит, что эффект кротонового масла обратим в отличие от результатов аналогичного эксперимента с ДМБА, суммация действия которого (мы об этом говорили ранее) была правилом.

Инициация необратима

Продолжительность отрезка времени с момента инициации до начала обработки кротоновым маслом не столь существенна. Латентный период и выход опухолей остаются теми же — как в случае проведения активации сразу, так и через 40 недель. Это означает, что инициированные клетки сохраняются и, если можно так сказать, «ожидают сигнала» от кротонового масла. Подобная стабильность поистине поразительна, ибо за 40 недель популяция эпидермальных клеток часто полностью сменяется и генерация клеток, обработанных канцерогеном, уже давно сменилась новыми клетками. Следовательно, видоизмененная генетическая информация потенциальных опухолевых клеток должна быть неоднократно переписана.
Однако такой вывод вовсе не является обязательным, поскольку измененные клетки могут находиться в ткани и быть исключенными из процесса постоянной клеточной регенерации. Правда, такая альтернатива представляется несколько искусственной, более вероятной кажется все- таки гипотеза, допускающая процесс полной смены эпидермальных клеток. На фиг. 13 представлены две модели, отличающиеся друг от друга пространственной ориентацией митоза. Модель Б позволяет легко объяснить, почему число опухолевых центров на протяжении длительного отрезка времени остается постоянным и почему даже по прошествии года сохраняется постоянная цифра выхода опухолей. Правда, у этой модели один недостаток: возможно, она совершенно неверна.

ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК В ЭПИДЕРМИСЕ МЫШИ
Фиг. 13.
Модель А кажется более вероятной, поскольку «выскальзывающие» клетки, показанные на схеме, действительно наблюдаются под микроскопом (Иверсен). По сообщению Буллоу, в эпидермисе мыши митозы ориентируются, как правило, таким образом, что обе дочерние клетки остаются в базальном слое: «Вероятно, только благодаря возрастающему давлению клетки  выдавливаются в наружные слои, где начинается синтез кератина». Авторадиографические исследования также подтверждают модель А. Иверсен пометил эпидермальные клетки, находящиеся в S- фазе, тимидином, меченным по тритию, и проследил за смещением метки. Как оказалось, лишь 10% меченых клеток сразу мигрируют в верхние слои, преобладающая же часть их после митоза остается в базальном слое. Карачай подтвердил наблюдения Иверсена методом авторадиографии.
Модель А позволяет также объяснить, почему число скрытых опухолевых клеток (в среднем) не меняется со временем. Однако вполне возможно, что случайные скрытые опухолевые клетки «выдавливаются» в соответствии с вышеупомянутым механизмом на поверхность и теряются, но большая часть скрытых опухолевых клеток по теории вероятностей остается в базальном слое. Иными словами, чем дольше период до начала обработки кротоновым маслом, тем больших колебаний в выходе опухолей можно ожидать- это значит, что число животных-опухоленосителей должно снижаться. И действительно, так произошло в одном случае из четырех известных авторам.

Универсальность двухступенчатой гипотезы подвергается сомнению

Опыты на ухе кролика и коже мыши относятся к числу наиболее важных, но не единственных примеров двухступенчатых экспериментов. Хаггинс проделал следующий замечательный опыт: одной группе крыс штамма, у которого никогда не наблюдались спонтанные саркомы, подкожно ввели сезамовое масло (часто используемый носитель для жирорастворимых соединений). Другая группа получала метилхолантрен (MX) с пищей. Ни у одной из групп подопытных животных опухоли не развивались. Но если крысам, которым скармливали MX, инъецировали к тому же сезамовое масло, то в месте инъекции у них развивались саркомы. Напрашивается вывод, что вводимый с пищей канцероген превращает некоторые клетки соединительной ткани в скрытые опухолевые клетки, которые затем активируются в результате раздражения, вызванного инъекциями масла.
Несмотря на все сказанное, индуцирование опухолей в соответствии с двухступенчатой схемой вряд ли найдет всеобщее экспериментальное применение. Если еще развитие лейкозов и может следовать этой схеме, то для индуцирования гепатом удовлетворительных двухступенчатых систем пока не найдено. Даже кожу мышей нельзя рассматривать просто как кожу: так, кожа хвоста устойчива по отношению к продолжительной обработке ДМБА, а кожа ушей не дает опухолей при смазывании ТПА, если одновременно скармливать животному ДМБА. У крыс стандартные двухступенчатые процедуры, направленные на индуцирование опухолей, дали отрицательные результаты.
Если же ДМБА или диэтилнитрозамин (ДЭНА) инъецировать в субпороговых дозах хомячкам, а затем дать им вдыхать порошок окиси железа (гематит), то развивается рак бронха. К таким же результатам приводит использование на втором этапе в качестве активного агента «неканцерогенной» двуокиси серы.

Синканцерогенез: канцерогены могут взаимно заменять друг друга

С открытием большого числа различных химических канцерогенов перед исследователями стал вопрос: запускает ли в движение все эти вещества некий единый механизм, ведущий к развитию опухолей. Канцерогены можно найти среди различных классов химических соединений, таких, как полициклические ароматические углеводороды, ароматические амины и нитрозамины. Уретан представляет собой минимальную комбинацию амида и эфира, а тиомочевина — это мочевина с атомом серы вместо атома кислорода.
Такая множественность физико-химических свойств позволяет предположить, что индуцирование, в частности, гепатом посредством введения ДАБ или ДЭНА происходит двумя совершенно различными путями. Однако подобное предположение полностью опровергается экспериментом. При одновременном скармливании обоих канцерогенов достаточно 60% минимальной дозы каждого соединения, чтобы вызвать опухоль (Шмель). Следовательно, ДЭНА в значительной мере способен заменять ДАБ.
И это далеко не единичный случай. В 30-0-х годах Хайджер и Раш уже показывали взаимозаменяемость 3,4-бензпирена и ДМБА, а Фридрих-Фрекса (1940) обнаружил, что метилхолантрен может заменять бензпирен и наоборот. Вполне допустимо, что близкородственные вещества, такие, как углеводороды, могут быть взаимозаменяемыми в этом плане. Однако даже совсем различные вещества (4-нитрохинолин-N-оксид и 3-метилхолантрен), по свидетельству Накахары, могут заменять друг друга в индуцировании рака кожи.
Особый интерес вызвали успешные попытки индуцировать рак кожи одновременно обработкой химическими канцерогенами и облучением. Хошино с соавторами вводил в субпороговых дозах 4-нитрохинолин-Н-оксид и одновременно подвергал (3-облучению 90Sr- при этом у животных развивались папилломы, фибросаркомы и карциномы. На основании полученных данных авторы пришли к выводу, что 4-нитрохинолин-1Ч-оксид и (3 -облучение обладают качественно эквивалентным действием.
Шмель на основании собственных опытов пришел к следующему выводу: «Суммация канцерогенных эффектов наводит на мысль, что место атаки канцерогенного фактора
в клетке должно быть строго фиксированным- в противном случае суммацию нельзя было бы объяснить».
(В опыте Хошино имеется одна существенная деталь: небезразлично, когда вводится 4-нитрохинолин-1Ч-оксид— до или после облучения.)
Не исключено, что взаимозаменяемость канцерогенов возможна не на всех этапах канцерогенеза. Согласно гипотезе Беренблюма и Рауса, это должно означать, что у различных канцерогенов первичные эффекты полностью различаются, но при этом канцерогены обладают одним общим свойством — способностью к активации.

Синканцерогенез и коканцерогенез: вопрос не только терминологический

Концепция синканцерогенеза (Бауэр) и концепция коканцерогенеза синонимичны лишь на первый взгляд. Под синкацерогенезом понимают синэргическое действие канцерогенов, в то время как под коканцерогенезом подразумевают факторы, которые способствуют канцерогенезу, но сами по себе не являются канцерогенными. Так, кротоновое масло — коканцерогенное вещество, которое само по себе неканцерогенно.
В строгом смысле слова кротоновое масло канцерогенно: при больших дозах можно получить достаточно высокий процент образования папиллом. Кротоновое масло представляет собой смесь многих веществ, и не исключено, что активирующие и канцерогенные свойства принадлежат различным его компонентам. Именно по этой причине Геккер фракционировал кротоновое масло, стремясь выделить и дать характеристику свойств чистых соединений. Но даже он не сумел ответить на первоначальный вопрос, поскольку чистый активатор в больших дозах все же проявил слабую канцерогенность.
В итоге был сделан следующий вывод: двухступенчатые эксперименты по существу представляют собой лишь особый случай синканцерогенеза- мы же наблюдаем взаимодействие различных канцерогенов, отличающихся только характером действия — потенциирующим или суммирующим. Если придерживаться такой точки зрения, то между инициацией и активацией не существует особых различий. Это, однако, находится в полном противоречии с фактами, изложенными выше, а они свидетельствуют о том, что
инициация в отличие от активации необратима. Кроме того, как уже указывалось ранее, возникновение опухоли зависит от последовательности воздействия ряда факторов. Например, обработка кротоновым маслом до нанесения канцерогена эффекта не дает. И последнее: мнимый канцерогенный эффект кротонового масла и его чистых компонентов легко объяснить — в эксперименте трудно исключить спонтанную инициацию опухолей в результате воздействия таких факторов, как ультрафиолетовое облучение или космические лучи. Кротоновое масло лишь проявляет спонтанно индуцированные скрытые опухолевые клетки.

Заключение

Химическое индуцирование папиллом на примере кожи мыши можно разделить на две фазы (стадии, ступени). В первой (инициация) индуцируются так называемые скрытые опухолевые клетки- во второй (активация) эти клетки, размножаясь, дают опухоль.
Активация может проходить под воздействием неканцерогенных веществ- к самым известным из них относится кротоновое масло. Инициация в отличие от активации необратима.
Однако двухступенчатая гипотеза укладывается не во все экспериментальные схемы.