Молекулярная биология и молекулярная генетика деменции - психиатрия позднего возраста
7 Молекулярная биология и молекулярная генетика деменции
Саймон Аавстоун
Введение
Молекулярная биология — это применение методов манипуляций с ДНК в экспериментальной биологии и описание соответствующей методологии. Этот термин используется также для описания результатов таких исследований. Аналогично, молекулярная генетика — это экспериментальная методология для изучения наследственных черт на уровне ДНК, опять же, этот термин используется более широко для описания результатов этих исследований. И молекулярная биология, и молекулярная генетика все более становятся технологически оснащенными, и их влияние на биологическую науку трудно переоценить. Действительно, они представили доказательства, являющиеся революционными. Используя технические достижения, можно исследовать функции на молекулярном уровне, дополнительно к структурным исследованиям, и, что наиболее впечатляет, можно конструировать модели отдельных процессов в клетках и живых организмах. В мельчайших деталях можно изучить функции индивидуальных белков и их взаимодействия с другими компонентами клеток, а также исследовать мелкие и крупные изменения в белковой последовательности.
В области нейронаук молекулярная биология и генетика значительно продвинулись вперед. Благодаря их огромному вкладу в психиатрию позднего возраста, особенно в последнее десятилетие, улучшилось понимание болезни Альцгеймера (БА) в такой степени, что патогенез этого состояния можно экспериментально воспроизвести на молекулярном уровне. Изменилось наше понимание и других, более редких, деменций, особенно спонгиоформных (губчатых) энцефалопатий. Однако следует отметить, что молекулярные науки оказали небольшое влияние на результаты исследования остальных психических расстройств. Причины этого не полностью ясны, но, вероятно, связаны со сложностью, неоднородностью и неясной природой аффективных расстройств и психозов, наряду со сложностью взаимодействия средовых и личностных факторов. Когда исследователи молекулярных процессов смогут объединить усилия с эпидемиологами, бихевиористами и учеными других психологических дисциплин, тогда результаты молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований психических нарушений в пожилом возрасте будут поистине великолепными. Пока же вполне достаточно того «взрыва» в исследованиях деменций, который мы сейчас наблюдаем.
Болезнь Альцгеймера
Сенильные бляшки и отложения амилоида
Амилоидные бляшки, большие экстрацеллюлярные структуры с сердцевиной из амилоидного вещества, окруженного дегенерирующими нейронами, — наверное, наиболее поразительные нейроморфологические изменения, которые описал Альцгеймер. Амилоид — это «особое вещество в коре мозга» (Alzheimer, 1907), которое откладывается в сердцевине бляшек в виде фибрилл толщиной 9-10 нанометров и выявляется по бирефракционному зелено-красному окрашиванию под поляризованным освещением. Это общее свойство всех амилоидных протеинов и результаты вторичной структуры полипептидов, принимаемой ими in vivo. Вдобавок к накоплению внутри бляшек, амилоидные фибриллы при болезни Альцгеймера также откладываются в стенках мелких кровеносных сосудов коры, и эти сосуды также обнаруживают по двойной рефракции в поляризованном свете. Вследствие образования антител к сердцевинному протеину бляшек было проведено иммуногистохимическое исследование и впервые выявлены диффузные аморфные структуры, которые невидимы при стандартном окрашивании тканей мозга гематоксилин- эозином или импрегнации серебром. Такие патологические изменения, известные как диффузные бляшки, обычно обнаруживают у молодых пациентов с болезнью Дауна перед появлением распространенных бляшек и формированием клубков. Это послужило толчком к предположениям, что они — ранние предшественники сенильных бляшек у лиц, страдающих болезнью Альцгеймера (Mann et aL, 1990). Были продолжительные споры о роли отложений амилоида в молекулярном патогенезе БА, но большинство исследователей с готовностью согласятся с тем, что отложения амилоида — необходимое, если не достаточное, условие для развития болезни (Selkoe, 1994).
Амилоидный протеин был впервые выделен из стенок менингеальных кровеносных сосудов больного БА (Glenner and Wong, 1984), а вскоре был выделен из самих бляшек (Masters et al, 1985). Этот 39-43-аминокислотный пептид, амилоидный протеин, амилоид, и сам по себе происходит из более крупного мембраносвязанного протеина — белка- предшественника амилоида (БПА- Kang et al,1987). Значительные усилия были приложены к выяснению клеточной роли БПА, его нормального и патологического метаболизма и эффектов агрегации АР in vivo.
Множественные изоформы БПА генерируются путем альтернативного сплайсинга одиночного гена в 21-й хромосоме. В некоторых изоформах есть зона, гомологичная ингибитору протеаз типа Кунитц (ИПК), но в мозге больного БА излишняя мРНК (а следовательно, наиболее избыточный протеин), похоже, относится к БПА695, у которого недостает ИПК-домена (Palmert et al, 1988). БПА широко представлен во многих тканях и in situ находится трансмембранно, его небольшое амино-окончание направлено внутрь клетки, а большое карбоксиокончание — в экстрацеллюлярное пространство. Фрагмент АР находится в протеине в зоне, фиксированной внутри наружной клеточной мембраны (рис. 7.1). Точная функция БПА все еще не определена. В любом случае она скорее всего различна в разных тканях. Предположение об общей, или формообразующей, функции БПА сделано на основе наблюдений, что протеин проявляет значительный эволюционный консерватизм с межвидовым сходством, и того факта, что он является частью семьи гомологичных протеинов (в том числе подобных предшественникам амилоида (ПППА) 1 и 2). Растворимые формы БПА, содержащие ИПК-домен, идентичны протеину, который раньше считался протеазосвязывающим протеином 2. Известные функции этого протеина по аналогии наводят на мысль, что роль БПА заключается в обеспечении сильного взаимодействия между клетками. Дальнейшие предположения, что БПА действует как медиатор клеточных контактов, исходят из свидетельств его способностей влиять на адгезивные и ростовые качества нейрональных клеток в культуре (Schubert et al, 1989- Milward et al., 1992- Chen and Yankner, 1991).
Структура генов и пути продукции протеинов более сложные, чем кто-либо мог предположить, когда Уотсон и Крик описали химическую структуру ДНК и ее роль в наследственности. Генетический материал содержится в уникальных структурах, закодированных нуклеотидными основаниями в ДНК Большая часть ДНК, однако, представляет собой некодирующий материал Частично он, как установлено, выполняет функцию генетических пусковых и других контрольных механизмов Между тем как значительная часть ДНК состоит из некодирующих зон внутри генов, известных как интроны, а значительное количество ДНК находится между генами с неизвестной функцией. Собственно гены состоят из ДНК, кодирующей структуру протеинов (экзонов), некодирующей ДНК между экзонами (интронов) и контрольных последовательностей. Экзоны транскрибируются в РНК, которая, в свою очередь, трансформируется в протеин. Различные изоформы протеинов могут продуцироваться путем альтернативного сплайсинга — механизма, каким РНК разных видов продуцируется путем транскрипции различных экзонов или зон кодирования ДНК.
Таким образом, в результате транскрипции всех экзонов гипотетического 4-экзонного гена появляется самая крупная изоформа, транскрипция экзонов 1, 2 и 4 продуцирует меньшую изоформу, а транскрипция экзонов 1 и 4 — еще меньшую Оказывается, что во многих отношениях природа — консерватор и у некоторых генов есть общие кодирующие последовательности или гомологии. Они стали могущественным инструментом в биологии, так как по компьютерным программам можно сканировать уже бесконечные геномные базы данных в поисках гомологичных областей. У генов с похожими последовательностями обычно сходные функции. В межвидовой гомологии предполагаются тесные эволюционные взаимосвязи между видами в отношении гена такой важности и полезности, что его структура в течение эволюции не изменилась.
Поразительный пример полезности поисков гомологичных зон представляет генетика БА В начале лета 1995 года были идентифицированы мутации гена в 14-й хромосоме. Просматривая геномные базы данных, другая группа исследователей часто обнаруживала похожий ген в 1-й хромосоме. Этот ген, ранее не представлявший никакого интереса для изучения БА, был у членов семей страдающих болезнью Альцгеймера , и была определена мутация, которая вызывает заболевание За несколько недель был идентифицирован ген, ассоциированный с семейной болезни Альцгеймера, — научное достижение, на которое в ином случае могло уйти много лет, даже при сегодняшнем стремительном темпе движения.
Отсюда следует, что если могут быть гомологичные друг другу гены, то могут существовать такие же протеины. Все больше появляется доказательств тому, что многие протеины являются членами целых семейств протеинов со сходной аминокислотной последовательностью, структурой и (часто) функцией.
Одним из наиболее полных отчетов об изумительной науке о генах можно найти в регулярно издаваемых «Генах» (изд В Lcwin, Оксфордское университетское издательство).
Рис. 7.1. Белок — предшественник амилоида (БПА). Изображены положение протеина в мембране, места расщепления и положение при мутации
Именно только фрагмент АР откладывается в бляшках и стенках сосудов лиц, страдающих болезнью Альцгеймера . Поэтому вероятно, что этот фрагмент появляется в результате патологического изменения родительской молекулы БПА. Однако сейчас понятно, что Ар — сам по себе нормальный, а не патологический продукт БПА. К несчастью, еще меньше известно о биологической роли Ар, хотя были продемонстрированы его интересные нейротропные качества (Whitson et al., 1989- Yanker et al., 1990).
Именно результаты исследований по внутриклеточному транспорту БПА рассеяли ранее существовавшее мнение, что Ар является патологическим продуктом метаболизма. Показано, что Ар секретируется разнообразными клетками и трансфицированными клеточными моделями помимо того, что он присутствует в ликворе пациентов и здоровых из контрольной группы (Haass et al., 1992а, Seubert et al, 1992, Shoje et al, 1992, Busciglio et al, 1993). Мембраносвязанный БПА расщепляется по меньшей мере двумя ферментами — а-секретазой (Esch et al., 1990) и p-секретазой (Seubert et al, 1993). Место расщепления а-секретазы находится внутри самого фрагмента Ар, производя продукты расщепления без интактного АР, тогда как в результате расщепления по месту p-секретазы продуцируется карбоксильный концевой фрагмент с интактной амилоидной (Ар) последовательностью. Мембраносвязанный БПА также может реинтернироваться в клетку внутри эндосом (Haass et al.,992b) — пузырьков, которые направляются к липосомам, содержащим протеазы. Интактные содержащие Ав-протеолитические фрагменты генерируются этим путем (Golde et al, 1992). Возможно, это и есть тот путь, которым генерируется нормальный секретируемый Ав (Коо et al., 1994).
Таким образом, в результате метаболизма БПА генерируется множество внутриклеточных продуктов, причем некоторые из них содержат интактную Ав-последовательность (амилоидогенный метаболизм). В секретируемых продуктах много как карбоксиокончаний БПА (БПАс), расщепленного а-секретазой, так и Ар.
В нормальном ликворе в основном находится АР, состоящий из 40 аминокислот (АР 1-40- VigoPelfrey et al., 1993). при болезни Альцгеймера, однако, АР откладывается в виде протеина, состоящего из 39-43 аминокислот, а в изобилии встречающиеся в бляшках и стенках сосудов наиболее часто содержат АР 1-42 (Miller et al, 1993- Roher et al., 1993). Кроме того, относительно нерастворимый АР 1-42 откладывается в начале болезненного процесса (Ivatsubo et al, 1995). Хотя АР — нормальный клеточный продукт, вероятно, что образование сравнительно более крупных изоформ бывает причиной болезненного процесса.
Понимание метаболизма БПА еще более осложняется тем наблюдением, что секреция протеолизированных а-секретазой фрагментов (БПАс) усиливается стимуляцией холинергических рецепторов. Мускариновые рецепторы, в частности М1/М3, похоже, повышают секрецию БПАс и снижают количество связанного клетками БПА (Nitsch et al, 1993, Haring et al, 1994). Поскольку место расщепления, по которому образуется БПАс, находится внутри последовательности Ар, как обсуждалось выше, результатом стимуляции М1/М3 будет уменьшение общего количества Ав-содержащих метаболических продуктов — снижение уровня «амилоидогенного» метаболизма БПА. Мускариновые рецепторы собраны в группы протеинов, — связывающих в основном протеины, киназы и фосфатазы, — которые передают сигнал активации рецепторов клетке. Было показано, что прямая активация элементов этих сигнальных каскадов нисходящим путем от мускариновых рецепторов также влияет на метаболизм БПА (Buxbaum et al). Более того, установлено, что амилоидогенный метаболизм в фибробластах, взятых от индивидов со шведской мутацией БПА, может быть снижен соединениями, которые действуют этим путем (Felsenstein et al, 1994). Связав структурные изменения при болезни Альцгеймера (отложение амилоида в бляшках) с известными функциональными изменениями (преимущественным истощением холинергического пути), можно получить перспективные возможности терапии.
Если БПА — широко представленный и эволюционно неизменный протеин, а Ар — нормальный метаболический продукт, то какую роль эти протеины играют в БА? Убедительные свидетельства патологической роли амилоида исходят из данных генетических исследований, обсуждаемых ниже, и недавно созданных на животных моделей. Однако некоторые данные экспериментов in vitro позволяют предположить, что, несмотря на то, что Ав — нормальный продукт метаболизма, сам по себе он нейротоксичен. Эта нейротоксичность регулируется физическим состоянием АР, причем фибриллярный амилоид больше нейротоксичен, чем неагрегированный растворимый АР (Pike et al, 1993- Simmons et al, 1994).
Таким образом, патологический процес с болезнью Альцгеймера может ускоряться не самим по себе Ав, а сборкой in vivo этого пептида в фибриллярный амилоид внутри альцгеймеровских сенильных бляшек.
Еще один ключевой вопрос, который следует адресовать исследователям амилоида: каков механизм нейротоксического воздействия агрегированного Ар? Предполагалось прямое участие АР в генерации свободных радикалов (Behl et al, 1994- Hensley et al, 1994), изменениях в нейрональном кальциевом гомеостазе (Mattson et al, 1992) или его косвенное действие как очага генерации воспалительного ответа (Rogers et al, 1992). Каким бы ни был механизм повреждения нейронов, индуцированный накоплением Ав, нейрогистологический процесс при болезни Альцгеймера включает нейрофибриллярные клубки. Поэтому в любой убедительной модели БА можно проследить связь между формированием бляшек и образованием клубков. Результаты некоторых исследований позволили предположить, что в нейронах, живущих в культуре, препараты Ар частично индуцируют молекулярные изменения, обнаруженные в нейрофибриллярных клубках (Greenberg et al, 1994). Однако в других исследованиях была продемонстрирована прямая физическая связь между Ар и основными белковыми компонентами клубков (Smith et al, 1995). Вопрос, индуцирует ли АР формирование нейрофибриллярных клубков прямым, непрямым или даже обратным путем при определенных обстоятельствах, когда образование клубков способствует отложению амилоида, должен остаться для споров и дальнейших исследований.
