Выявление опухолевых маркеров в крови и других биологических жидкостях - общая онкология
За очень редким исключением иммунная система больных толерантна к тем соединениям, о которых пойдет речь ниже. Поэтому они выступают как антигены только при введении экспериментальным животным для получения антител и в диагностических иммунологических реакциях. Понятно, что каждое антигенно-активное соединение выполняет в организме определенные функции (гормональные, ферментативные, транспортные и пр., в ряде случаев неизвестные), но их рассмотрение не входит в задачи данного раздела.
Началом клинической иммунодиагностики в онкологии следует считать открытие Г. И. Абелевым и соавт. (1963) в сыворотке мышей с перевитой гепатомой белка, синтезируемого в большом количестве в эмбриогенезе и обнаруживаемого у взрослых особей лишь в следовых количествах. Год спустя Ю. С. Татаринов установил наличие аналогичного белка в крови больного первичным раком печени, впервые показав клиническую значимость теста. В 1965 г. P. Gold и S. Feedman обнаружили, что в опухолевой ткани больных раком толстой кишки присутствует гликопротеин, названный ими раковоэмбриональным, характерный для эмбрионального кишечника и синтезируемый в ничтожных количествах эпителием кишки взрослых лиц. Сходный антиген, присутствовавший в экстрактах эмбриональной кишки и опухолях этой локализации у человека, был обнаружен также В. Я. Рогальским (1964). Эти открытия положили начало новому направлению в онкологии, а такие вещества получили название онкофетальных антигенов. К настоящему времени из соединений этого ряда в опухолях найдено еще не менее 10 эмбриоспецифических антигенов [Embryonic antigens in cancer, 1980]. В основе их применения для иммунодиагностики опухолей лежит наличие в малигнизированных клетках, крови, асцитической жидкости, моче повышенных концентраций веществ, характерных для определенного этапа эмбрионального развития.
Среди других соединений, циркулирующих в кровотоке онкологических больных и используемых для иммунодиагностики, следует назвать гормоны: гипофизарные, хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, пролактин, инсулин, паратгормон и тиреокальцитонин. В этом случае, если речь не идет о новообразованиях эндокринных органов, диагностика основана на том, что опухолям нередко присущ так называемый эктопический синтез гормонов, которые присутствуют при этом в крови или в моче больных в значительно больших концентрациях, чем у здоровых лиц. В сыворотке крови больных могут присутствовать также в повышенной концентрации такие белки, как ферритин, казеин и пр., синтезирующиеся и нормальными клетками. Из названных соединений наибольшую практическую ценность имеют а-фетопротеин (АФП), раковоэмбриональный антиген (РЭА) и хорионический гонадотропин (ХГ), трофобластический в-глобулин.
а-Фетопротеин — а-глобулин с относительной молекулярной массой около 70000 — синтезируется в эпителии желточного мешка и эмбриональных гепатоцитах. Его концентрация в сыворотке плода и амниотической жидкости достигает 3 г/л к 12—14 нед. внутриутробного развития, снижаясь к моменту рождения до 50 мг/л сыворотки. У здоровых лиц, за исключением беременных женщин, его содержание не превышает 5 — 25 мкг/л сыворотки. Незначительное повышение этого уровня у взрослых указывает, как правило, на регенераторный процесс в печени, сопровождающий вирусный гепатит или цирроз- обычно это наблюдается у 10—20% больных. У детей 1-го года жизни практически при любом заболевании наблюдается повышение АФП в крови. Из других заболеваний неопухолевой природы, сопровождаемых повышением содержания АФП в крови, следует назвать врожденную тирозинемию и атаксиютелеангиэктазию.
Выраженный и стойкий подъем концентрации АФП в крови взрослых людей чаще всего встречается при гепатоцеллюлярном раке и зародышевых тератокарциномах яичка и яичников, значительно реже — при метастатических поражениях печени. Уровень АФП у больных гепатоцеллюлярным раком может превышать фоновый в несколько сотен и даже тысяч раз, чаще колеблясь от 40 мкг/л до 3 мг/л. В зависимости от чувствительности метода определения количество АФП-положительных раков печени составляет среди взрослых 45 — 80 %, а среди детей — 60 — 95%. Практически в 100% случаев АФП присутствует в концентрации свыше 1 мг/л у детей с гепатобластомами эмбрионального типа.
Имеется генетическая предрасположенность к экспрессии синтеза АФП. Так, жители тех районов Азии и Африки, где частота первичного рака печени выше, чем у европейцев, до 90% случаев являются АФП-положительными. Нередко повышенная концентрация АФП определяется в сыворотке практически здоровых жителей «эндемичных» по данному заболеванию ареалов [Purves L. et al., 1973].
Обычно четкой корреляции между концентрацией АФП в крови больных гепатоцеллюлярным раком, размерами опухоли, гистологической структурой и стадией заболевания нет. Несколько чаще маркер синтезируется в высоких концентрациях клетками умеренно дифференцированных гепатом.
Повышенная концентрация АФП в крови может на 2—10 мес. предшествовать клинической симптоматике рака печени L. Leblane и соавт. (1973) наблюдали подъем АФП у 6 из 9864 сенегальцев, не предъявлявших каких-либо жалоб. В последующем при детальном клиническом обследовании у них был диагностирован гепатоцеллюлярный рак. Однако еще в 3 случаях установлен тот же диагноз, хотя уровень АФП в крови был нормальным. При обследовании 343 999 китайцев [The Coordinating..., 1974] диагноз первичного рака печени был поставлен на основании повышенной концентрации АФП в крови 147 лицам без каких-либо других признаков опухолевого процесса- в дальнейшем только 18 случаев оказались ложноположительными. Сообщается о «доклинической» иммунодиагностике гепатоцеллюлярного рака у 5 из 200 наблюдавшихся больных циррозом печени [Lehmann F., 1975]. Таким образом, АФП пригоден для раннего выявления первичного рака печени.
Тератокарцинома яичка и яичников характеризуется повышенным содержанием АФП в крови более чем в 90% случаев. В этих случаях концентрация АФП почти всегда выше 1 мг/л сыворотки, а у взрослых больных такое количество обнаруживается не более чем в 40% случаев, в остальных оно ниже. Опухоли половых желез, происходящие не из элементов желточного мешка, хотя и зародышевого типа (семиномы, дисгерминомы, хориокарциномы, зрелые тератомы), никогда не сопровождаются продукцией АФП [Абелев Г. И., Эльгорт Д. А., 1978], что лежит в основе дифференциальной диагностики таких опухолей от тератокарцином. Однако в АФП-положительных случаях следует иметь в виду возможность смешанного строения опухоли, например наличие в семиноме элементов желточного мешка.
При опухолях других локализаций повышение АФП в крови наблюдается крайне редко, и при этом его концентрация, как правило, не превышает 25 — 500 мкг/л в сыворотке. Такие же количества присутствуют обычно в сыворотке больных с метастазами в печень опухолей других локализаций и прежде всего — желудочно-кишечного тракта. Поэтому стойкий уровень АФП выше 1 мг/л сыворотки крови чаще всего свидетельствует либо о гепатоцеллюлярном раке, либо о тератокарциноме половых желез.
После радикального хирургического вмешательства или успешного химиотерапевтического лечения АФП-продуцирующего новообразования концентрация маркера в крови в течение нескольких дней снижается до нормальных величин. (Период полужизни АФП составляет 5 сут). Последующее нарастание АФП свидетельствует о рецидиве или метастазировании опухоли. Нередко оно происходит еще до появления клинических симптомов и может служить основанием для повторного оперативного или другого лечения. Таким образом, АФП может быть прогностическим опухолевым маркером. Однако следует иметь в виду, что в ряде случаев исчезновение АФП из крови леченых больных гепатоцеллюлярным раком не является свидетельством радикальности лечения. Объясняется это тем, что АФП синтезируется не стволовыми гепатоцитами, а коммитированными в одно из направлений дифференцировки. Если к цитостатическому воздействию окажется чувствительным только такой клон, то это приведет к ложноотрицательному диагнозу.
Поскольку концентрация АФП у больных гепатоцеллюлярным раком и тератокарциномами половых желез в большинстве случаев достаточно высока, для иммунодиагностических целей приемлемы все широкодоступные иммунодиффузионные методы. Более того, специфичность диагностики при использовании методов с низкой чувствительностью (1 — 3 мг/л) существенно выше, чем при использовании, например, высокочувствительного радиоиммунологического анализа, улавливающего в 1000 раз меньшие концентрации антигена в растворах. Это вполне понятно, если учесть вышеизложенные данные о незначительных транзиторных повышениях его уровня в сыворотке крови при различных неопухолевых заболеваниях.
Раковоэмбриональный антиген — гликопротеин с относительной молекулярной массой около 200000, синтезируемый в большом количестве энтероцитами кишечника 3 — 6-месячного плода. Обнаруживается в амниотической жидкости, крови и меконии. У взрослых содержание РЭА в сыворотке очень низкое (менее 2,5 — 5 мкг/л). У хронических курильщиков эти цифры выше.
Специфичность РЭА для дифференциальной диагностики ниже, чем АФП. С наибольшим постоянством (до 90% случаев) он повышен в крови больных раком толстой кишки (причем чаще левого отдела) и поджелудочной железы. По обобщенным данным, РЭА выявляется также у 25 — 40% больных раком легкого, около 40% больных саркомами, 15% больных меланомами, 20 — 30% больных опухолями яичников, 30 — 50% больных медуллярным раком щитовидной железы и мочевого пузыря, у 20% больных раком шейки матки и 20 —30% —раком молочной железы, реже у больных опухолями других локализаций. Как правило, высокодифференцированные раки активнее продуцируют РЭА. Уровень РЭА повышен также в сыворотке 50 — 70% больных язвенными колитами и терминальным илеитом (болезнь Крона), панкреатитами, алкогольным циррозом печени, у 15% больных доброкачественными полипами толстой кишки. При инфекциях мочевого пузыря РЭА определяется в моче более чем у 50 % больных.
Имеется наследственная предрасположенность к интенсивному синтезу РЭА. Среди членов «высокораковых» семей, особенно у близких родственников больных со злокачественными опухолями легких, молочной железы, толстой кишки, нередко наблюдается повышенная концентрация РЭА [Guirgis Н. et al., 1978]. Интересно, что РЭА может быть повышен также у супругов онкологических больных, что свидетельствует о роли факторов окружающей среды в экспрессии синтеза этого маркера. Причины такой неспецифичности РЭА кроются, возможно, в использовании разными группами исследователей нестандартизованных сывороток к очень сходным, но не идентичным антигенным детерминантам. В. Я. Рогальский (1975) считает, что РЭА — нормальный продукт слизепродуцирующих клеток и его повышение при опухолях — лишь результат усиленной секреции. Не исключено, что РЭА -продукт пролиферирующих стволовых клеток. Во всяком случае, в экспериментах на животных с интенсивной посттравматической пролиферацией энтероцитов наблюдалось такое же повышение РЭА, как и при индуцированных опухолях толстой кишки [Пожарисский К. М., Окулов В. Б., 1976].
Содержание РЭА в сыворотке онкологических больных обычно не превышает 40 — 70 мкг/л. Метастазы РЭА- продуцирующей опухоли также синтезируют этот гликопротеин. Установлена корреляция уровня РЭА в крови со стадией процесса и размерами опухоли. Если при раке толстой кишки, локализованном в слизистой оболочке, РЭА повышен у 20% больных, то при прорастании опухоли в подслизистый слой он повышен уже у 50% больных, а при наличии метастазов в печень — у 100% больных. Сходная зависимость продемонстрирована у больных раком молочной железы. Это делает РЭА малопригодным для раннего выявления новообразований при массовых обследованиях лиц, составляющих группы повышенного риска. Имеются, однако, сообщения, что повышенный уровень РЭА был единственным признаком новообразования кишечника, на 2 — 6 мес. предшествовавшим клиническим проявлениям болезни.
РЭА оказался надежным маркером при контроле за эффективностью лечения больных. Уже через несколько дней после радикального удаления опухоли содержание антигена в крови нормализуется. К аналогичному результату приводит успешное химиотерапевтическое или лучевое лечение- в этих случаях корреляция наблюдается в 70 — 90% случаев. Если РЭА присутствует в моче больных раком мочевого пузыря, бронхиальном секрете больных раком легкого или кале больных раком толстой кишки, то после радикального удаления опухоли РЭА в них не определяется. Паллиативное лечение не сопровождается снижением концентрации РЭА в крови. Более того, если после хирургического вмешательства снижения ее не происходит, то это считается неблагоприятным прогностическим признаком.
Новый подъем содержания РЭА свидетельствует о рецидиве опухоли или о развитии метастазов и в 60 — 70% случаев наблюдается за 5 — 12 мес. до появления клинической симптоматики. Зарубежные клиницисты рассматривают такой подъем как безусловное показание к повторной диагностической операции (second look operation). Для того, чтобы вовремя диагностировать прогрессирование процесса, определение РЭА производят не реже 1 раза в 2 мес., и тогда в подавляющем большинстве случаев рецидив опухоли окажется операбельным.
Определенное прогностическое значение может иметь уровень РЭА до лечения, так как у больных опухолями одного гистогенеза продолжительность жизни после установления диагноза обычно короче в случаях с более высокой концентрацией РЭА в крови. Такая же зависимость характерна для больных с диссеминированными формами рака. Следует заметить, что информативность результатов существенно повышается при динамическом наблюдении за уровнем РЭА.
Предпринимаются попытки использовать антитела к РЭА в качестве носителя радионуклидов для сканирования опухолей толстой кишки и их метастазов. При соблюдении некоторых условий, исключающих неспецифичность распределения и фиксации меченых антител, результаты оказываются вполне удовлетворительными.
Хорионический гонадотропин, известный с 1927 г. благодаря работам Ашгейма и Цондека, начал применяться в качестве маркера опухолей после открытия у него антигенных свойств и разработки высокочувствительных методов определения [Vaitukaitis J. et al., 1972].ХГ представляет собой гликопротеин с относительной молекулярной массой около 60000 и состоит из а- и (3-цепи- в последней локализована специфическая иммунохимическая детерминанта. У здоровых женщин ХГ синтезируется начиная с 6-го дня беременности, и концентрация его в моче достигает максимума к 60-му дню- после 18 нед. количество ХГ снижается.
Основным онкологическим заболеванием, при котором имеется высокий уровень ХГ в крови, является метастазирующая хорионэпителиома, при которой он определяется в 100% случаев, при этом, как и при беременности, имеется корреляция между содержанием ХГ в моче и крови больных. Если суточная экскреция ХГ с мочой превышает 100000 ME*, то прогноз чаще всего неблагоприятный. Прослеживается отчетливая обратная корреляция между количеством экскретированного ХГ и выживаемостью больных, что может быть отражением прямой корреляции между опухолевой массой (включая метастазы) и концентрацией ХГ в крови.
* В зависимости от степени очистки 1 ME соответствует 50-200 нг.
Эффективное лечение сопровождается исчезновением ХГ из крови и мочи через 6—12 нед. Если в течение последующих 3 — 4 нед. нового подъема не происходит, то это можно рассматривать как показатель стойкой ремиссии, а отсутствие подъема в течение 3 мес. в 95% случаев гарантирует полное излечение.
Другой патологией, характеризующейся наличием ХГ в моче и крови больных, являются новообразования яичка. В зависимости от гистологического строения опухоли ХГ выявляется радиоиммунологическим методом у 15 — 55% больных, наиболее часто при эмбриональной карциноме. Как правило, чем больше опухоль, тем выше уровень ХГ в крови. Исчезновение ХГ после лечения свидетельствует о радикальности последнего, а повторный подъем — о рецидиве болезни. При опухолях другого гистогенеза ХГ определяется у 5 — 30% больных [Braunstein G., 1979], и при этом содержание его в сыворотке крови не превышает 10 мкг/л. Тем не менее изменение концентрации этого маркера в процессе лечения и последующего наблюдения за больными с нетрофобластическими опухолями может оказаться весьма полезным.
Заключая разбор практической ценности иммунологических опухолевых маркеров, необходимо подчеркнуть, что только динамическое или как минимум неоднократное определение их уровня у больных предоставляет клиницисту весомые дополнительные возможности в диагностике, увеличивающиеся при одновременном определении двух и более маркеров.
Изложенный материал свидетельствует о том, что этот подход к иммунодиагностике опухолей разработан достаточно подробно и уже внедрен в практику крупных онкологических учреждений у нас в стране и за рубежом. Результаты, получаемые различными учреждениями, вполне сравнимы, что позволяет обобщать их и делать соответствующие выводы. Этому будет в значительной мере способствовать внедрение в лабораторную практику коммерческих моноклональных антител, так как они, являясь продуктом потомков одной клетки-продуцента, абсолютно «моноспецифичны».
Что касается двух других подходов,
о которых речь пойдет ниже, то здесь делать серьезные обобщения пока преждевременно, так как результаты, получаемые в различных лабораториях, существенно отличаются друг от друга, а нередко и противоречивы. Поэтому здесь они изложены в общих чертах*.
* Более подробно см. Immunodiagnosis of cancer, 1979- Immunodiagnosis and immunotherapy of the malignant tumours, 1979, а также подразделы «Лабораторные методы диагностики» и «Влияние внутренней среды на возникновение и развитие опухолей».
Выявление иммунного ответа на ассоциированные с опухолями антигены.
Выше уже было отмечено, что четких доказательств существования специфических опухолевых антигенов пока не получено. Однако изучение системы иммунитета у больных позволяет обнаружить в ней некоторую перестройку, что может свидетельствовать об антигенных отличиях нормальных клеток от малигнизированных. Поскольку иммунологический ответ развивается и на очень незначительные количества антигенов, можно ожидать, что он возникает уже на ранних этапах опухолевого роста. С другой стороны, следует иметь в виду, что противоопухолевые реакции организма могут не проявляться на фоне сниженной иммунореактивности больных, что особенно часто наблюдается в далеко зашедших стадиях опухолевой болезни.
Выявление противоопухолевого иммунитета для диагностических целей основывается на изучении реакций клеточного и гуморального иммунитета. Среди первых наиболее употребительны: внутрикожная проба на водносолевые экстракты опухолей, специфическая цитотоксичность лимфоцитов к опухолевым клеткам, угнетение миграции лейкоцитов опухолевыми антигенами, пролиферация лимфоцитов под действием опухолевых антигенов, электрофоретическая подвижность макрофагов, угнетение прилипания лейкоцитов. Гуморальный противоопухолевый иммунитет исследуется с помощью реакций, позволяющих определять антитела против опухолевых клеток и так называемые блокирующие антитела, иммунные комплексы и уровень иммуноглобулинов различных классов.
Внутрикожные пробы на опухолевые антигены являются наиболее простыми для выполнения. Они оказались положительными у больных раком кишечника, молочной железы, меланомой, острым лейкозом. В частности, при последней патологии удалось проследить зависимость напряженности иммунитета от стадии заболевания. Считается, что проба может быть использована для прогнозирования: чем выраженнее кожная реакция на ассоциированный с опухолью антиген, тем напряженнее иммунитет, тем лучше прогноз. Возможный иммунный ответ на опухолевые антигены на «доклинической» стадии предполагает практическую ценность внутрикожной пробы для скрининга лиц, составляющих группы повышенного риска. Однако введение даже бесклеточных опухолевых экстрактов практически здоровым людям нельзя считать абсолютно безопасной манипуляцией, поэтому проба не нашла широкого применения. Для этого можно использовать экстракты эмбриональных тканей, и такие исследования уже проводятся.
Изучение цитотоксических свойств лимфоцитов больных по отношению к опухолевым клеткам основано на работах I. Hellstrom и соавт. (1971), впервые продемонстрировавших этот феномен. Тест наиболее специфичен для оценки противоопухолевого иммунитета, однако в силу немалых сложностей выполнения большого практического значения в настоящее время не имеет и чаще используется в фундаментальных исследованиях.
Большее применение имеет реакция подавления миграции лейкоцитов в присутствии опухолевого антигена, которая является информативной не только в аутологичной, но и в гомологичной системе, т. е. наблюдается в присутствии экстрактов опухолей одного гистогенеза, полученных от разных больных. В ряде случаев удалось продемонстрировать общность антигенов в опухолях различного гистогенеза. Реакция с успехом применялась у больных раком молочной железы, желудка и кишечника, меланомой, лимфомами и лейкозами. Наиболее тесная корреляция отмечена между результатами реакции и прогнозом. Специфичность и информативность метода может быть повышена при параллельной постановке с аутологичной и донорской сыворотками.
Следует упомянуть также о тесте прилипания лейкоцитов, основанном на различной способности сенсибилизированных и интактных лимфоцитов прикрепляться к внутренней поверхности специальных лабораторных планшетов или пробирок в присутствии аутологичных или аллогенных (стандартных) опухолевых экстрактов. Есть сообщения о том, что при соблюдении ряда методических приемов этот метод вполне информативен. В частности, предоперационная реактивность больных коррелирует с продолжительностью жизни.
В последнее время привлекает внимание метод определения электрофоретической подвижности макрофагов в присутствии опухолевых экстрактов [Pritchard J. et al., 1973]. Метод обладает высокой специфичностью, и результаты в 60 — 80% случаев коррелируют со стадией опухолевого процесса. Однако ряд недостатков не позволяет внедрить метод в широкую практику.
Имеются единичные наблюдения по корреляции титра противоопухолевых гуморальных антител и блокирующих антител с клиническим состоянием больных. Большее практическое значение имеет определение гуморальных антител к антигену, ассоциированному с вирусом Эпстейна — Барр у больных лимфомой Беркитта и назофарингеальной карциномой. Титр таких антител повышен практически у 100% больных, что используется для дифференциальной диагностики, а в некоторых случаях для контроля за клиническим состоянием больных.
Иммунодиагностическое значение реакций противоопухолевого иммунитета ограничивается тем, что ответ организма на опухолевые антигены индивидуален и зависит от многих факторов. Общим моментом, препятствующим широкому внедрению данного подхода в практику, является отсутствие высокоочищенных опухолевых антигенов, так что использование многокомпонентных экстрактов вносит дополнительные сложности в интерпретацию результатов. Поэтому только динамическое наблюдение за состоянием противоопухолевого иммунитета в сравнимых условиях поможет клиницисту в решении лечебных задач.
Определение «неспецифических» показателей иммунитета для диагностики опухолей. Теория иммунного надзора Бернетта подразумевает, что опухоли возникают на фоне сниженной реактивности иммунной системы организма. Несмотря на то, что эта теория в значительной мере пересмотрена, так как многие ее положения не подтверждаются экспериментальными и клиническими наблюдениями, во многих случаях у больных, страдающих опухолями, удается выявить снижение иммунокомпетентности.
Одним из наиболее распространенных методов является внутрикожная проба на динитрохлорбензол (ДНХБ). Сенсибилизирующей и разрешающей инъекциями этого препарата определяется способность организма отвечать реакцией гиперчувствительности замедленного типа на антиген, с которым организм раньше не встречался. Ответ на него тимус зависимый и характеризует состояние клеточного иммунитета. Проба проста в выполнении и в начале 70-х годов получила повсеместное распространение. Было установлено снижение реактивности на ДНБХ у больных с опухолями практически всех локализаций. У больных неоперабельным раком легкого и шейки матки показано ухудшение результатов пробы в зависимости от тяжести прогноза. Имеются сведения об изменении чувствительности к ДНХБ и при послеоперационных рецидивах опухолей указанных локализаций, а также о корреляции со стадией процесса. Вместе с тем широкая вариабельность результатов снижает диагностическую ценность пробы. Кроме того, последующие введения препарата осуществляются уже на сенсибилизированном организме, что препятствует применению пробы в динамике заболевания.
Способность иммунокомпетентных лимфоцитов отвечать на воздействие митогенами растительного происхождения (например, фитогемагглютинином) реакцией трансформации в бластные формы является показателем их функциональной состоятельности. У больных с опухолями эта реакция снижена, однако, по обобщенным данным, достоверно это определяется лишь в далеко зашедших стадиях болезни. Существенной корреляции между степенью угнетения реакции бласттрансформации лимфоцитов и прогнозом не найдено.
Относительно надежным показателем иммунного статуса организма является количество циркулирующих Т- и В-лимфоцитов. Их определение в онкологической практике п
